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用R2A培養基提高飲用水中細菌總數檢出率



錄入時間:2015-7-8 15:35:13 來源:青島海博生物

   平板計數瓊酯(Plate Count Agar,PCA)是用來檢測飲用水中異養菌(Heterotrophic Plate Count,HPC)的常用培養基,其營養含量高,歷史上應用最廣泛。但從2O世紀7O年代末開始,越來越多的檢測證實,采用PCA 將明顯低估了異養菌的真實數量,根據PCA計數結果來評價水處理的有效性及管網的清潔、衛生程度并不可靠,飲用水的致病風險很可能較預期高得多。提高檢測技術的靈敏度,獲得盡可能高的計數仍應視為飲用水微生物學研究的重要內容。

1 HPC結果偏低的原因分析

   PCA等培養基可能只檢出了水樣細菌總數中很少的一部分,其他未檢出細菌根本就不能在檢測環境中生長,或者生長相對緩慢,在設定時間內不能形成可見菌落。

1.1 細菌存活但不能被檢出

   弧菌(Vibrio)、埃希氏菌(Eschericha)、沙門氏菌(Salmonella)、氣單胞菌(Aeromonas)、彎曲桿菌(Campylobacter)、志賀氏菌(Shigella)等都被證實存在具有生命活性但不能被培養檢出。在培養基平板上,這些細菌不能形成可見菌落,但存活直接培養表明它們具有代謝活力。顯而易見,常規檢測技術遺漏了這些細菌,造成結果報告偏低。這也可用來解釋發生軍團菌流行病時,往往不能從水樣中檢出侵肺軍團菌(Legionella pneumophila)等致病菌的現象。

1.2 培養基的選擇性

   由于細菌生理、生化特征的多樣性、沒有哪種培養基可將水樣中的存活細菌全部檢出,每種培養基都趨向于只計數適應該種營養條件的一類細菌。如果某種培養基的選擇性弱,則其可檢出更大量的細。

   用目前可利用的幾種培養基檢測相同水樣,計數結果往往有顯著差異,表明這些培養基都具有較強的選擇性。此外,由于對出廠水或管網水進行了消毒處理,只有少數優勢種才能存活、繁殖,培養基選擇對其能否被檢出影響相當大,有的培養基可能根本就不支持這些優勢種的生長,有的則比較正常。

1.3 培養方法的固有缺陷

   用傾倒平皿檢測法,培養基平板上生長起來的菌落可能起源于單個或多個細菌。如果是多個細菌團聚在一起,或者多個細菌同時粘附到某個無機或有機顆粒物表面,而水樣前處理,主要是人工或機械混勻,不能使團聚或粘附細菌彼此分離,則最終只能形成一個菌落,必然導致對總數量的低估。

1.4 細菌的脅迫受損與再生長

   消毒不充分或樣水保存不當都可能使細菌處于亞致死的受損狀態。這些結構或代謝受損的細菌不能在含有表面活性劑的選擇性培養基上生長并形成菌落。然而,進入管網后,受損細菌可能完成恢復性生長,以致管網末梢水中細菌的檢出量高于出廠水。由于表面的物理保護作用,顆粒物,包括顆;钚蕴(GAC),往往成為受損菌的重要載體n]。種源

菌在管網內繁殖再生長,帶來的不利影響包括:(1)產生異臭異味;(2)微生物腐蝕管道內壁;(3)干擾對大腸菌的檢測;(4)消毒劑殘余量低或失效期間的健康風險,如假單胞菌(Pseudomones)、莫拉氏菌(Moraxella)或黃桿菌(Flavobacterium)等的致病作用。環境溫度、水中可生物降解有機物的含量、水流速度、水體濁度、管網中消毒劑殘余量等控制受損菌的再生長程度。

   傾倒平皿檢測法使細菌遭受熱沖擊,受損菌可能不能在檢測期內修復生長,導致少計。

   有機物組成廣泛但含量低的培養基有利于受損菌修復生長。為更真實地檢出水中細菌的數量,適當調整培養基組成是必要的。

2 提高HPC計數結果的途徑

   使用PCA培養基,用傾倒法檢測水中細菌總數的技術穩定,但由于PCA具有選擇性,而且不能檢出產色素菌,因此降低了反映真實結果的價值,需要改進現行方法,提高檢測靈敏度。

2.1 直接計數法

2.1.1 掃描電鏡觀察計數

   用掃描電鏡計數水生細菌是有效的l2],其技術關鍵有2點:(1)要能將水樣中的細菌全部分離出來;(2)具備區分細菌與非細菌成分的熟練技術。

2.1.2 熒光顯微鏡觀察計數

   熒光顯微鏡觀察計數法快捷,從取樣到檢出只要20—30分鐘,而且靈敏性好。操作程序是先固定水樣,然后用化學熒光物染色,再真空過濾到不產生熒光的聚碳酸酯膜上,最后在熒光顯微鏡下觀察。吖啶橙色染料(Acridine Orange,AO)是常用染色物質,能與RNA和DNA反應而產生熒光。與其他直接計數技術一樣,熒光顯微鏡觀察法不能區分細菌種類,分析代謝活性或判斷是否處于存活狀態。如果由于工作經驗不足,將死亡細菌、碎屑物混計在內,則會過高估計活細菌總數。有些研究將AO染色與測代謝活性的方法結合起來,如A()-INT[3],提高了檢測準確性。

直接計數法獲得的結果往往較標準平板法高出2個甚至更多個數量級。

2.2 改進接種方法

   傾倒平板法雖然簡單,但缺點也非常明顯:(1)盡管要求將培養基的傾倒溫度控制在45—46~C,然而熱沖擊依然存在;(2)平板表層以下的菌落生長慢,而且不便于轉種培養;(3)水樣體積的限制(<2ml)

   實踐表明下述兩種接種方法的應用效果良好。

2.2.1 均勻涂布接種

   首先是制備具有吸附能力的干燥培養基。將15mL已滅菌培養基倒入lOOmm×15mm 或90mm×15mm平皿中,翻轉,42℃恒溫固化24 h,使水分喪失2~3g后立即使用,或用塑料袋封好在4C儲存,有效期不應超過2周。如果需要當日制備并使用,則將25mL培養基倒入平皿中,不加蓋,室溫(24~ 26℃)下在層流通風柜內干燥,同樣使水分喪失2-3g。

   將0.1~0.5mL水樣均勻涂布到培養基表面的方法有兩種:(1)使用長200mm,直徑4mm,一端45。彎曲的玻璃棒,人工將樣水推開;(2)使用轉臺,將平皿固定在轉臺上,啟動旋轉,前后擺動移液管(止于距邊緣0.5cm處),將水樣緩慢釋放出來。不論采用何種方法,都要保證水樣被完全吸收。均勻涂布接種法獲得的結果總是不同程度地高出傾倒平皿法。尤其計數海洋細菌時,均勻涂布的平均計數幾乎為傾倒法的3倍。

2.2.2 濾膜計數法

   由Taylor和Geldreich提出了用濾膜計數水中細菌總數的方法l4],使用培養基命名為rn—sPC,已商業化生產,可在市場上購買到。濾膜法的優勢在于可檢測大量低濁度水樣,尤其適合分析潔凈水(< 1-10CFU/mL)。事實上,如果將水樣量由lOOmL增至300mL,細菌的檢出率明顯增加。在對722個水樣的檢測中,若只取1OOmL水樣,則有259例不能檢出,但將水樣量增至300mL,則其中32 的水樣有細菌有檢出。

   在大多數情況下,濾膜法獲得的計數結果高于傾倒平皿法。此外,產色素菌在濾膜上生長速度快,而且易挑出單菌落進行種類鑒定及生化分析。但是,濾膜法檢測可能受濾膜質量等因素影響。

2.3 調整培養溫度和時間

   出于腸道衛生學考慮,歷史上將培養細菌總數的環境溫度控制在37℃ ,后來確定為35℃ 培養48h。大量對比實驗表明,35℃ 肯定是最不適宜獲得最高菌落數的溫度,計數結果不及28℃ 時的14% ,20℃時的20 。鑒于細菌總數用作評價凈水效率的價值高于其衛生學意義,很多學者贊同降低培養溫度(20℃或28℃),延長培養時間(5~7d),以此促使最大數量的菌落出現在計數平板或濾膜上。細菌總數會隨培養時間延長而增加。一般情況下,12~14d可達到最高計數,而在前6天,增長速率最快。對平板計數技術,最快增長發生在前2~4d。溫度越高,達到50 最高菌落數所需時間越短。如以12~ 14d最高值為標準,則達到5O 數量,35℃ 需4d,28℃ 需6d,20℃ 需8d。長期培養不適合開展常規檢測。建議在盡可能短的時間內完成計數,必要情況下,將已計數平板繼續培養,定期觀察,記錄最大值。

2。4 選用替代培養基

   目前可利用的替代培養基有高、低營養成分兩大類。高營養成分培養基有m—SPC培養基;低營養成分培養基有NWR1瓊酯、R2A 培養基、CPS培養基、DP瓊脂培養基,Henrici改良培養基等。

3 R2A培養基及其應用

3.1 R2A培養基的應用

   R2A培養基可用于傾倒平板、均勻涂布和濾膜檢測法。由于R2A培養基能促進受損細菌的恢復性再生長,其在20℃ 下培養7d獲得的最高菌落數總是高于PCA和m—SPC(表1)。從表中還可看出,R2A均勻涂布法計數結果更高。相對于PCA,細菌在R2A 培養基上的生長速度要慢,形成的菌落要小,在48h內,準確計數困難,因而需要延長培養時間,使菌落生長得足夠大,但不會或少融合生長。

   R2A培養基適合產色素菌生長。在3~5d內,產色素菌可形成明顯的菌落。均勻涂布法計數產色素菌所獲得的結果比較理想。耐氯菌在R2A 培養基上生長良好。28℃ 培養5~7d后,生長緩慢的耐氯菌菌落開始出現,其對1.Omg/L的游離余氯的抵抗力很強。將PCA 上生長的菌落挑出,轉培養到新配PCA上,則有很多不能再生長。但如果將丙酮酸鈉以外的R2A其他組成成分雙倍配制,則新的培養基適合分離菌株的轉培養,從而有利于進行種類鑒定和生化特征研究。

R2A培養基已成功地用來檢測飲用水樣、GAC、管道內壁生物膜、污損反滲透膜內異養菌的數量,在可比培養條件下,R2A 計數結果總是最高的,但也不排除由于地理區域差異,水中細菌種群不同,R2A培養基上生成菌落數反而減少的情況。

4 提高飲用水中細菌檢出率的技術細節考慮

   細菌總數是評價飲用水水質的常規檢測項目,一些技術細節的規范化處理或改進有助于提高計數準確性,應嚴格按規程操作,本文不一一贅述。

 

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