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細菌的生理、生化試驗簡介



錄入時間:2015-5-13 9:09:13 來源:青島海博生物

    微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物,生化反應常用來鑒別一些在形態和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一,微生物檢驗中常用的生化反應介紹如下:

一、糖酵解試驗

  不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異,或能利用或不能利用,能利用者,或產氣或不產氣?捎弥甘緞┘鞍l酵管檢驗。

  試驗方法:以無菌操作,用接種針或環移取純培養物少許,接種于發酵液體培養基管中,若為半固體培養基,則用接種針作穿刺接種。接種后,置36±1.0°C培養,每天觀察結果,檢視培養基顏色有無改變(產酸),小倒管中有無氣泡,微小氣泡亦為產氣陽性,若為半固體培養基,則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡,有時還可看出接種菌有無動力,若有動力,培養物可呈彌散生長。本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發酵能力,從而進行各種細菌的鑒別,因而每次試驗,常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫,溴百里藍和An-drade指示劑。

二、淀粉水解試驗

  某些細菌可以產生分解淀粉的酶,把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再變藍色。

  試驗方法:以18~24h的純培養物,涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板(一個平板可分區接種,試驗數種培養物)或直接移種于淀粉肉湯中,于36±1°C培養24~48h,或于20℃培養5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養表面,若為液體培養物,則加數滴碘試劑于試管中。立即檢視結果,陽性反應(淀粉被分解)為瓊脂培養基呈深藍色、菌落或培養物周圍出現無色透明環、或肉湯顏色無變化。陰性反應則無透明環或肉湯呈深藍色。

  淀粉水解系逐步進行的過程,因而試驗結果與菌種產生淀粉酶的能力、培養時間,培養基含有淀粉量和pH等均有一定關系。培養基pH必須為中性或微酸性,以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱,因而以臨用時制備為妥。

三:V-P試驗

  某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸,丙酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強堿環境下,被空氣中的氧氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物,稱VP+)反應。

  試驗方法:

 。保OMeara氏法:將試驗菌接種于通用培養基,于36±1°C培養48h,培養液1mlOMeara試劑(加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine40%氫氧化鈉水溶液)1ml,搖動試管1~2min,靜置于室溫或36±1°C恒溫箱,若4h內不呈現伊紅,即判定為陰性。亦有主張在48~50°C水浴放置2h后判定結果者。

 。玻Barritt氏法:將試驗菌接種于通用培養基,于36±1°C培養4天、培養液2.5ml先加入a萘酚(2-na-phthol)純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml,搖動2~5min,陽性菌常立即呈現紅色,若無紅色出現,靜置于室溫或36±1°C恒溫箱,如2h內仍不顯現紅色、可判定為陰性。

 。常┛焖俜ǎ簩0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產酸反應的三糖鐵瓊脂斜面培養物一接種環,乳化接種于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氫氧化鈉水溶液2滴,振動后放置5min,判定結果。不產酸的培養物不能使用。

  本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細菌時,通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產生,故應省去或以氯化鈉代替。

四:甲基紅(Methyl Red)試驗

  腸桿菌科各菌屬都能發酵葡萄糖,在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸,進一步分解中,由于糖代謝的途徑不同,可產生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物,可使培養基PH值下降至pH4.5以下,使甲基紅指示劑變紅。

  試驗方法:挑取新的待試純培養物少許,接種于通用培養基,培養于36±1°C30°C(以30°C較好)3~5天,從第二天起,每日取培養液1ml,加甲基紅指示劑1~2滴,陽性呈鮮紅色,弱陽性呈淡紅色,陰性為黃色。迄至發現陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結果。

  甲基紅為酸性指示劑,pH范圍為4.4~6.0,其pK值為5.0。故在pH5.0以下,隨酸度而增強黃色,在pH5.0以上,則隨堿度而增強黃色,在pH5.0或上下接近時,可能變色不夠明顯,此時應延長培養時間,重復試驗。

五:靛基質(Imdole)試驗

  某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。

  試驗方法:將待試純培養物小量接種于試驗培養基管,于36±1°C培養24h時后,取約2ml培養液,加入Kovacs氏試劑2~3滴,輕搖試管,呈紅色為陽性,或先加少量乙醚或二甲苯,搖動試管以提取和濃縮靛基質,待其浮于培養液表面后,再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數滴,在接觸面呈紅色,即為陽性。

  實驗證明靛基質試劑可與17種不的靛基質化合物作用而產生陽性反應,若先用二甲苯或乙醚等進行提取,再加試劑,則只有靛基質或5-甲基靛基質在溶劑中呈現紅色,因而結果更為可靠。

六、硝酸鹽(Nitrate)還原試驗

  有些細菌具有還原硝酸鹽的能力,可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。

  試驗方法:臨試前將試劑的A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養物或瓊脂斜面培養物表面,立即或于10min內呈現紅色即為試驗陽性,若無紅色出現則為陰性。

  用α-萘胺進行試驗時,陽性紅色消退很快、故加入后應立即判定結果。進行試驗時必須有未接種的培養基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時應加注意。

七、明膠(Gelatin)液化試驗

  有些細菌具有明膠酶(亦稱類蛋白水解酶),能將明膠先水解為多肽,又進一步水解為氨基酸,失去凝膠性質而液化。

  試驗方法:挑取18~24h待試菌培養物,以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點種于平板培養基。于20~22℃培養7~14天。明膠高層亦可培養于36±1℃。每天觀察結果,若因培養溫度高而使明膠本身液化時應不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細菌液化,如確被液化,即為試驗陽性。平板試驗結果的觀察為在培養基平板點種的菌落上滴加試劑,若為陽性,10~20min后,菌落周圍應出現清晰帶環。否則為陰性。

八、尿素酶(Urease)試驗

  有些細菌能產生尿素酶,將尿素分解、產生2個分子的氨,使培養基變為堿性,酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導酶,因為不論底物尿素是否存在,細菌均能合成此酶。其活性最適pH7.0。

  試驗方法:挑取18~24h待試菌培養物大量接種于液體培養基管中,搖均,于36±1℃培養10,60120min,分別觀察結果;蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面,不要到達底部,留底部作變色對照。培養2,424h分別觀察結果,如陰性應繼續培養至4天,作最終判定,變為粉紅色為陽性。

九、氧化酶(Oxidase)試驗

  氧化酶亦即細胞色素氧化酶,為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶,氧化酶先使細胞色素C氧化,然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化,產生顏色反應。

  試驗方法:在瓊脂斜面培養物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴,陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色,Ewing氏改進試劑呈藍色。陰性者無顏色改變。應在數分鐘內判定試驗結果。

十、硫化氫(H2S)試驗

  有些細菌可分解培養基中含硫氨基酸或含硫化合物,而產生硫化氫氣體,硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。

  試驗方法:在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養基中,沿管壁穿刺接種,于36±1℃培養24~28h,培養基呈黑色為陽性。陰性應繼續培養至6天。也可用醋酸鉛紙條法:將待試菌接種于一般營養肉湯,再將醋酸鉛紙條懸掛于培養基上空,以不會被濺濕為適度;用管塞壓住置36±1℃培養1~6天。紙條變黑為陽性。

十一、三糖鐵(TSI)瓊脂試驗

  試驗方法:以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養物,穿刺接種并涂布于斜面,置36±1℃培養18~24h,觀察結果。

  本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發酵產酸或產酸產氣(變黃);產生硫化氫(變黑)。葡萄糖被分解產酸可使斜面先變黃,但因量少,生成的少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細菌利用培養基中含氮物質,生成堿性產物,故使斜面后來又變紅,底部由于是在厭氧狀態下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色。

十二、硫化氫-靛基質-動力(SIM)瓊脂試驗

  試驗方法:以接種針挑取菌落或純養物穿刺接種約1/2深度,置36±1℃培養18~24h,觀察結果。培養物呈現黑色為硫化氫陽性,混濁或沿穿刺線向外生長為有動力,然后加Kovacs氏試劑數滴于培養表面,靜置10min,若試劑呈紅色為靛基質陽性。培養基未接種的下部,可作為對照。

  本試驗用于腸桿菌科細菌初步生化篩選,與三糖鐵瓊脂等聯合使用可顯著提高篩選功效。

 

 

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