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抗生素微生物檢定管碟法在中國藥典中的應用及操作要點



錄入時間:2010-11-18 10:29:10 來源:青島海博

     抗生素微生物檢定法可分為:(1)稀釋法;(2)比濁法;(3)瓊脂擴散法(管碟法和打孔法)。各國藥典通常采用后兩種方法測定抗生素的效價。
    
管碟法:利用抗生素在攤布特定試驗菌的固體培養基內成球面形擴散,形成含一定濃度抗生素球形區,抑制了試驗菌的繁殖而呈現出透明的抑菌圈。
    
此法系根據抗生素在一定濃度范圍內,對數劑量與抑菌圈直徑(面積)呈直線關系而設計,通過檢測抗生素對微生物的抑制作用,比較標準品與供試品產生抑菌圈的大小,計算出供試品的效價。
    
原理:利用抗生素在固體培養基中的平面擴散作用,依據量反應平行線原理并采用交叉實驗設計方法,在相同實驗條件下通過比較標準品(已知效價)和供試品兩者對所接種試驗菌產生的抑菌圈(直徑或面積)大小,來測定供試品效價的一種方法。

管碟法的操作步驟:
    1
、預試驗:確定最佳的試驗條件:調整試驗菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養基等,使抑菌圈的大小符合規定:一劑量法中心點的抑菌圈直徑應在1617.5mm,二劑量法高劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在1822mm,三劑量法中間劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在1518mm。
    2
、試驗準備:雙碟、鋼管、毛細滴管、吸管的清洗及滅菌;容量瓶、定量吸管的清洗;培養基、緩沖液的準備、半無菌間的紫外消毒等。
    3
、雙碟的制備:每只雙碟加底層培養基約20ml,待培養基凝固后,將雙碟放入3537
培養箱中,待用。
    4
、供試品、標準品溶液的制備:估計供試品的效價,根據試驗要求設計供試品、標準品溶液稀釋步驟,平行制備供試品、標準品相關劑量的溶液。
    5
、菌層的制備:注意菌層培養基溫度;根據預試驗確定加入菌層培養基的菌液量,注意制備菌層的速度和平整度。
    6
、滴加抗生素溶液:注意標準品、供試品高、低劑量溶液滴加順序,保證滴加速度和加量的均勻一致。
    7
、雙碟的培養:根據培養溫度的要求在培養箱中進行培養,培養箱中水平碟放的雙碟數以不超過三層為宜。
    8
、抑菌圈的測量:抑菌圈測量儀的使用,每組試驗雙碟應在相同的測量參數下進行測量。手工測量:游標卡尺
    9
、結果的可靠性檢驗及效價測定:抑菌圈測量儀提供計算結果或手工計算結果。

操作要點
    
第一步一般應制成5001000單位/毫升的溶液,以后逐步稀釋至供試濃度的溶液,稀釋步驟應為34步。
    
溶解:對于需用乙醇溶解的樣品,由于溶解樣品時所用乙醇量較大,加滅菌水后溶液放熱,因此需充分搖勻后加滅菌水至接近容量瓶刻度,待冷至室溫后再稀釋至刻度。
    
標準品溶液與供試品溶液濃度的比值D應控制在±5%以內,以保證兩者濃度的偏差在一定范圍內。
    
試驗菌的菌齡對抑菌圈有一定影響。故檢定時應保持菌種及菌液的新鮮。
    
一般菌種一月轉種一次,冰箱冷藏保存。對易變異的菌株,如藤黃微球菌等在制備菌懸液前進行單菌分離;其他菌株可半年分離一次。
    
試驗菌傳代最好不超過5次,以防止菌種老化變異。芽孢桿菌培養物用滅菌水洗下后,應在65加熱30分鐘,使菌體的菌齡一致,用革蘭氏染色,應有芽孢85%以上。
    
加入菌懸液的體積,一般不少于0.3ml,并且不大于上層培養基體積的2%。如果加入菌懸液的體積過小,則在同次實驗中,不同次加入菌懸液的體積相差較大,造成實驗誤差;如果加入菌懸液的體積過大,則會使上層培養基變稀,并且因菌懸液的溫度較低,加至培養基中可能造成培養基結塊,影響測定結果。對于加入菌懸液體積的控制,可通過調節菌懸液的濃度來實現。
    
在制備菌層培養基時,將菌液加入菌層培養基后,立即充分搖勻,但應避免產生氣泡。
    
加入芽孢懸液時,菌層培養基的溫度為65,對非芽孢懸液時,菌層培養基的溫度一般為4850
。
    
放置孵箱培養時排放應不得超過三層,避免因培養溫度不均勻而導致各雙碟中抑菌圈大小不一。

    
抗生素原料藥:不含輔料的藥物制劑原料,一般其效價以純度(u/mg?g/mg)表示。檢驗時,可參考該品種的藥品標準純度限度規定或廠方提供的純度估計效價,取樣試驗,如估計效價與實際效價相差較遠時,即測定所得效價超出估計效價的±10%時,則重新估計效價,再做準確測定。
    
粉針劑:指注射用無菌粉末或凍干品,用西林瓶橡膠塞鋁蓋封裝或熔封在安瓶內,一般測定其純度(u/mg?g/mg)或整瓶效價。
    
取裝量差異項下的內容物,稱取適量(50mg以上,根據標示量及平均裝量折算估計效價,并按估計效價及量瓶體積計算取樣量),置量瓶中,加標準中規定的溶劑溶解,稀釋,測定,計算出1mg的效價單位數,再根據平均裝量及標示量計算平均每瓶的百分含量。
水針劑(注射液):即抗生素的滅菌水溶液,標示量一般按每毫升含效價單位計。
    
效價測定時,量取平均裝量項下的內容物或510支的內容物,混勻,用干燥的刻度吸管吸取一定量的供試品,將吸管外壁用濾紙拭凈,再棄去多余的溶液,使供試品至吸管刻度,沿量瓶頸部內壁緩緩流入已盛有一定量溶劑(以免抗生素結晶析出)的量瓶內,混勻,繼續加溶劑至刻度,搖勻,再量取適量稀釋至規定的濃度。
    
素片、薄膜衣片:稱取20片的總量,求出平均片重,研細混勻后,精密稱取適量(約相當于1片的重量或根據標示量按平均片重及所用量瓶體積折算取樣量),置量瓶中,用標準中規定的溶劑溶解,并稀釋至刻度,搖勻。再量取適量稀釋至規定濃度。
    
注意點:研磨時應注意環境干燥,可在干燥操作柜內操作,研磨要迅速,避免吸濕,因片劑內含輔料較多,輔料可能漂浮于溶液表面,稀釋時量取供試溶液應讀取輔料下層的溶液切面;如沉淀較多,須待其下沉后再量取上層液;有些輔料吸附抗生素,應加以注意。為節約供試品,可與重量差異檢查結合進行。
    
糖衣片、腸溶片:取標準中規定的片數,置于乳缽中,研細,分次加入規定的溶劑,研磨使其溶解,將研磨液轉移至瓶口放有小漏斗的量瓶中,量瓶體積根據供試品標示量、所取片數及抗生素儲備液濃度(一般為1000單位/ml)選定,用規定溶劑稀釋至刻度,搖勻,靜置,使輔料下沉而抗生素已溶解在溶液內,精密吸取量瓶中的上層液適量,作進一步稀釋。個別品種標準如同時收載了糖衣片和薄膜衣片,可能規定薄膜衣片也取整片制備供試溶液。
    
膠囊劑:取裝量差異項下的內容物,混合均勻,研細,根據平均裝量,精密稱取約相當于1粒膠囊的量或按標示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量,置于量瓶中,加規定的溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,如供試品含有較多的輔料,則照片劑項下的方法進行。
    
顆粒劑、干混懸劑:取裝量差異項下的內容物,混勻,根據平均裝量,精密稱取約相當于1袋(包)的量或按標示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量,置于量瓶中,加規定的溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻。量取適量稀釋制成供試品溶液。測得效價后,再根據裝量差異項下的平均裝量,計算出平均每袋(包)的效價,根據標示量即可算出含量。
    
軟膏劑、眼膏劑:擦凈軟膏劑或眼膏劑軟管的外壁,切開封口,置于干燥器內約1小時,取干燥的潔凈分液漏斗,帶手套操作,將膏劑軟管連同內容物在天平上稱重,取出,將內容物擠入分液漏斗,量約2g,再稱取膏劑軟管的重量,按減重法以前后稱量之差計算分液漏斗內膏劑供試品的量,以不含過氧化物的乙醚或石油醚等作溶劑溶解基質,但基質中的抗生素則應不溶于或幾乎不溶于該有機溶劑中,以避免提取過程中抗生素的損失。按標準中的規定加提取溶劑至分液漏斗中,振搖,使基質溶解,用規定的緩沖溶液提取抗生素至水相中,用緩沖溶液提取3次,合并3次的提取液,置量瓶中,加緩沖溶液至刻度,依法操作,計算效價。

實驗要點
    
磷霉素鈉,磷霉素鈣,磷霉素氨丁三醇
    
主要問題:抑菌圈偏小
    
解決:
1. pH9.0
號培養基(pH7.88.0
2.
滴加藥液后,室溫放置1小時后,放入孵箱內培養。
3.
培養時間以24小時為宜,培養時間短,抑菌圈清晰度不好,培養24h后如抑菌圈仍不清晰,應室溫放置一段時間待清晰后再測量。

啤酒酵母菌的培養
    
主要問題:生長不良
    CP2005
:抗
號瓊脂斜面及抗瓊脂斜面
    
解決:1. 采用沙氏或YPD酵母菌培養基;2. 3235
培養24小時

    
沙氏培養基
蛋白胨10g 葡萄糖40g
瓊脂13g 1000ml
調節滅菌后pH5.45.8

    YPD
培養基
蛋白胨10g 葡萄糖40g
酵母粉5g 瓊脂13g
1000ml

管碟法特點:
    
優點:基本操作和設計適用于各種抗生素,試驗結果較穩定;樣品用量少,靈敏度高;適合于大批樣品的測定。

    
缺點:凡具有抗菌活性的物質都會干擾測定結果;試驗過程長,需第二天才有結果;操作手工化,需熟練人員才能得到較正確的結果;受擴散因素的影響,如培養基原材料的質量,一般瓊脂中的雜質可能影響擴散速度及效價強度

 

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