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引起基因工程菌質粒不穩定的原因



錄入時間:2023-11-7 16:05:55 來源:青島海博生物

在重組菌分裂時,母細胞中的質粒在兩個子代細胞中的分配往往是不均勻的,在極端情況下,其中一個子代細胞可能不含有質粒。在質粒中加入抗性標記不但能用來篩選含質粒細胞,而且也可以用于在培養過程中防止不含質粒細胞的大量繁殖。例如,若質粒上已經含有卡那霉素抗性基因,就可以在培養基中加入一定濃度的卡那霉素,這樣,不含質粒細胞無法生長,而含質粒細胞的生長不受影響。另外,在質粒構建時應該加入稱為 par和cer的位點,par位點能夠在細胞分裂過程中使質粒分布更均勻,cer位點則能夠防止多聚體質粒的形成,從而能從源頭上提高質粒穩定性。若細胞中所含質粒數目較少,分裂時形成不含質粒細胞的概率就會大大增加,因此一般推薦使用高拷貝質粒。

工程菌培養的環境對質粒穩定性也有很大的影響,溶氧濃度、培養溫度、培養基組成及連續培養時的稀釋率等都會影響質粒穩定性,需要進行優化。一般而言,適當降低菌體的生長速率,將有利于提高重組細胞內質粒的拷貝數,防止在細胞分裂時產生不含質粒細胞。

質粒還會形成多倍體。在細胞分裂時,多倍體在子細胞中的分配只相當于一個單倍體。因此多倍體或高聚多倍體的比例越高,不含質粒細胞出現的概率也就越高。

其他造成宿主細胞丟失外源質粒的因素還有很多。大量合成的外源蛋白質會對宿主細胞的生長產生危害,含質粒細胞的生長速度總是要比不含質粒細胞的生長速度低,而且所含的質粒越多,生長速度越慢;質粒會形成多倍體,形成二倍體、四倍體等。雖然多倍體也能夠復制,但是多倍體的形成減少了細胞內質粒的數目,提高了細胞分裂時產生不含質粒子細胞的概率。另一類質粒不穩定性是由質粒本身或宿主細胞的基因突變引起的。例如,由于基因突變,使有些質粒中的抗性基因有可能整合到宿主細胞的染色體DNA,使宿主細胞也獲得了抗性,在這種情況下,即使在培養基中加入了抗性物質,這類不含質粒細胞也能生長。

宿主細胞的突變會引起目標蛋白質表達的下降,特另別是當質粒中的啟動子受到宿主細胞所產生的某種蛋白質調節時,突變可能引起該蛋白質合成成能力的下降,使啟動子的啟動轉錄能力降低,目標蛋白的合成能力也就受到了影響。例如,當質粒采用lac啟動子時,需要加入乳糖或其類似物IPTG誘導才能表達,細胞吸收乳糖或IPTG需要lac滲透酶的協助下才能通過細胞膜。如果宿主細胞發生突變使lac滲透酶失活舌,將造成誘導劑被拒之細胞外。這樣雖然已經加入了誘導劑,也無法啟動目標產物表達。

 

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