一般來說，通過示蹤劑技術和代謝中間產物的鑒別足以確定抗生素的生物合成途徑，但是只有證實微生物中確實存在催化這些反應的酶時，研究工作才能算完成。酶的鑒別可以采用一般的生物化學方法，需要先將酶分離提純，在無細胞體系中研究酶的催化活性和酶學性質。如果微生物產生的是一組結構類似的抗生素，則有必要搞清楚不同代謝產物的前體——產物關系。
隨著基因重組技術的進展，不需要任何有關酶的知識就可以確定合成抗生素的基因。因為基因序列的確定比蛋白質中氨基酸序列的測定要容易得多，因此從基因序列及已知的初級和次級代謝產物基因的基礎上，可以確定酶的結構和性
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