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示蹤劑技術



錄入時間:2023-9-11 15:08:05 來源:青島海博生物

為了確定構成最終產物分子的初級代謝產物“建筑構件”的來源,一種最有用的技術是應用放射性同位素標記的示蹤劑。將具有放射性同位素14C、3H或13C標記的抗生素生物合成前體物質加人生產該抗生素的微生物培養基中,最佳加人時間是微生物生長階段的末期,當培養結束后,將抗生素分離、提純,然后測定結合到抗生素分子中的同位素,從放射性同位素的計數就可以獲得前體物質結合到抗生素分子的程度。在分析數據時應該注意兩點:一是示蹤物質雖然是抗生素合成的前體物質,但由于不能通過微生物的細胞壁吸收而得出不是前體物質的錯誤結論,事實上如果該物質能夠進人細胞內就可以結合到抗生素分子中;二是在抗生素分子中雖然檢測出了示蹤物質,但示蹤物質已經在細胞中通過其他代謝途徑降解,真正結合到抗生素分子的是示蹤物的降解產物。為了避免上述誤差,可以采用雙重標記的示蹤物,如前體分子同時有14C和3H的標記。

在確定了抗生素分子中結合進去了某一前體物后,下一個任務是確定該前體在抗生素分子結構中的位置,這樣就要將抗生素分子降解為一定的小片段,然后確定標記物在哪一個片段中,這是一個困難而又耗時的工作。一個比較有效的替代方法是用13C標記的前體物。13C在自然界的豐度有11%,表面看來似乎會干擾測定結果,但它的優點是能夠合成13C的含量高達99%的化合物,因此自然豐度的干擾可以忽略不計。將用13C合成的前體加入培養基中進行抗生素發酵,得到的產物可以直接用核磁共振(NMR)譜峰的高度增加值判斷抗生素分子的每個碳原子中13C所占的分數。如能采用雙重標記的前體物,則可以根據譜峰多重性的高分辨分析和偶合常數來判斷兩個原來相連的原子在經過復雜的代謝過程后是否還繼續相連,或連接鍵雖然已經斷裂但經不同的途徑結合到了抗生素分子中。

   如果不能確定合理的前體物,則可以采用放射性標記的更普通的底物分子,如葡萄糖或甘油,同時結合中間代謝產物的確定,也能對研究抗生素代謝途徑提供有用的信息。此外,用氘標記的前體物產生的抗生素用NMR譜進行研究也很有用,氘在質子共振譜中不出現譜峰,很容易鑒別。

 

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