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大腸埃希氏菌實驗常見培養基簡述

王天宇
錄入時間:2023-4-25 15:49:54 來源:青島海博生物

  大腸埃希氏菌(Escherichia coli)通常被稱為大腸桿菌。其對營養要求不高且傳代速率較快,具有完整的基因組序列信息和清楚的遺傳學背景。目前廣泛應用于微生物學的各個領域。

  培養基作為細菌生長的溫床,是細菌培養和傳代的基礎。大腸埃希氏菌在不同的培養基上也會產生不同的性狀,依據這些性狀,可以將部分菌種進行特異性識別,快速分辨出目標菌種。下面將從大腸埃希氏菌的分離和增菌兩部分進行培養基介紹。


1. 大腸桿菌增菌培養基

  在實驗室環境中,我們經常需要從各種樣品中分離得到單一的大腸埃希氏菌,這就需要培養基具有選擇性,但是我們收到的樣品可能常常面臨著細菌活性受抑制,大腸埃希氏菌并非優勢菌群等問題。有時我們也需要高純度高濃度的大腸埃希氏菌菌液來獲取其表達產物。這都需要我們對大腸埃希氏菌進行增菌培養。

  ① 胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)

  成分:單位g/L

胰蛋白胨

17.0

大豆蛋白胨

3.0

氯化鈉

5.0

磷酸氫二鉀

2.5

葡萄糖

2.5

  TSB是一種常見的非選擇性增菌液體培養基,其含有豐富的營養物質。大腸桿菌可以在TSB中生長和繁殖。表現為培養基渾濁。


  ② LB肉湯

  基因工程中常見的增菌培養基之一,在其中加入抗生素還可以特異性增菌有相關抗性基因表達的大腸埃希氏菌工程菌。

  成分:單位g/L

胰蛋白胨

10.0

酵母浸粉

5.0

氯化鈉

5.0



  ③ SOB培養基

  SOB也是基因工程培養中常用的富營養培養基。與LB培養基相比,SOB培養基含有兩倍的蛋白胨,能提供更豐富的營養。SOB中的鎂離子也是進行高密度培養的必須的離子。利用SOB培養基增菌大腸桿菌,在搖瓶培養的條件下,可以達到很高的濃度值。

  此外,基因工程中還常用到SOC、TB、SB、GYT、2x YT培養基等增菌培養基。其均所含豐富的營養,但用主要途不一,以不同比例的碳源,利用微生物利用碳源的優先級不同的原理,從而獲得傾向不同的表達產物。


2.大腸埃希氏菌分離培養基

  在日常的檢測或培養中,我們經常需要從含雜菌的樣品中分離獲得可疑大腸埃希氏菌菌落進行確證試驗。此時就需要使用到大腸埃希菌分離培養基。

  ① LB瓊脂

  在LB肉湯中加入瓊脂(15g/L)即可在使培養基在冷卻后凝固。在其中加入抗生素(如卡那霉素、氨芐青霉素)即可篩選對抗生素耐藥的細菌,去除對抗生素不耐藥的雜菌。通常,抗生素抗性基因是通過質粒所賦予的。例如加入卡那霉素后的LB瓊脂平皿,普通的大腸埃希氏菌無法生長,而含有卡那霉素抗性基因的DH5α大腸埃希氏菌則可以生長。


  ② 伊紅美藍瓊脂(EMB)

  EMB是一種弱選擇性的培養基,主要用于分離腸道致病菌,尤其是大腸埃希氏菌。

  成分:單位g/L

蛋白胨

10.0

乳糖

10.0

磷酸氫二鉀

2.0

瓊脂

15.0

伊紅

0.4

美藍

0.065

  蛋白胨作為基礎營養物質提供細菌生長所需的氮源以及其他營養元素;乳糖作為可發酵的碳源;伊紅和美藍同時作為抑制劑和指示劑,在酸性條件下產生沉淀,形成具黑色中心有金屬光澤或無光澤的菌落。伊紅為酸性染料,美藍為堿性染料,細菌分解乳糖產酸時,細菌帶正電荷,可以與帶負電的酸性染料結合即染上了伊紅的顏色;如果細菌因產堿性物質較多,帶負電荷時與帶正電荷的堿性染料美藍結合而使得菌落呈藍色。細菌產酸量較大時,染料可析出結晶形成金屬光澤。磷酸氫二鉀維持緩沖體系;瓊脂作為凝固劑。

  大腸埃希氏菌分解乳糖大量產酸,因此細菌菌落帶正電荷染上紅色,再與美藍結合形成紫黑色菌落且帶有金屬光澤。產氣腸桿菌產酸能力較大腸埃希氏菌弱,菌落呈棕色,很少有金屬光澤。不分解乳糖的細菌,如沙門氏菌和志賀氏菌(宋內志賀氏菌遲緩分解乳糖),則為無色或半透明的菌落。金黃色葡萄球菌則被抑制或僅呈現針尖大小的菌落。


  ③ 麥康凱瓊脂(MAC)

  麥康凱瓊脂常被縮寫為MAC瓊脂,是分離腸道菌最常見的瓊脂。在藥典中被用于大腸埃希氏菌的檢測,而在國標中用于腸道致病菌的分離(應注意不同標準中的麥康凱瓊脂成分并不完全一致)。

  成分:g/L

蛋白胨

20.0

乳糖

10.0

牛膽鹽

5.0

氯化鈉

5.0

中性紅

0.075

瓊脂

12.0

  培養基中含量較高的膽鹽對大多數革蘭氏陽性菌有很強的抑制效果。部分配方中還還有結晶紫,亦可加強對于革蘭氏陽性菌的抑制效果。中性紅在酸性條件下呈紅色,堿性條件下呈橙黃色。大腸埃希氏菌強烈發酵乳糖產酸,因此在培養基上呈現桃紅色菌落,并具有膽鹽沉淀環。大腸菌群同樣能發酵乳糖產酸,菌落呈桃紅色。

  沙門氏菌,志賀氏菌(除宋內志賀氏菌)等不發酵乳糖,因此菌落呈現無色,且培養過程中代謝產物氧化后PH會升高,平皿會呈現橙黃色。但MAC瓊脂較難分別出大腸埃希氏菌和大腸菌群,因此應按相應標準的要求繼續進行確證試驗。



麥康凱瓊脂培養基
麥康凱瓊脂
大腸埃希氏菌ATCC25922
福氏志賀氏菌CMCC(B)51572

  ④ 大腸桿菌顯色培養基

  大腸桿菌顯色培養基是利用酶底物法,讓大腸埃希氏菌在培養基上顯示出獨特顏色,與其他干擾菌區分開來,對于分離大腸埃希氏菌有高度的特異性。大腸埃希氏菌具有獨特的β-葡萄糖醛酸苷酶,可以分解培養基中的顯色底物,釋放出呈色團,讓大腸埃希氏菌落呈藍色。顯色培養基的分離效率要遠遠高于其他培養基,尤其當樣品的干擾菌較多時。但是其價格也相應較高。

  在此培養基中,其他菌落呈無色、白色或其他顏色,大多數革蘭氏陽性菌不生長。但是有極少數的大腸埃希氏菌不具有β-葡萄糖醛酸苷酶(如腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7)在此培養基上無法顯色。

大腸桿菌ATCC25922與產氣腸桿菌CMCC(B)45103在大腸桿菌顯色培養基上的生長現象


  ⑤ 含MUG的培養基

  大腸埃希氏菌具有β-葡萄糖醛酸苷酶,可以特異性分解MUG,被分解后產生熒光產物,在紫外燈下觀察時會有熒光。常用的有VRBA-MUG(紫紅膽鹽MUG培養基),NA-MUG(營養瓊脂MUG培養基),EC-MUG(含MUG的EC肉湯培養基),LST-MUG(含MUG的月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯培養基)等。

  但應注意,在使用含MUG的固體培養基時,因為熒光產物容易擴散到培養基內,應盡快觀察結果。在含MUG的液體培養基中,培養時間太久,細菌產酸過多時同樣會影響熒光效果。

大腸埃希氏菌ATCC25922在VRBA-MUG上的生長結果

弗氏檸檬酸桿菌ATCC43864在VRBA-MUG上的生長結果

EC-MUG培養基的生長結果

LST-MUG培養基的生長結果

  在日常的實驗中可選用的大腸埃希氏菌相關的培養基多種多樣。經過多年的發展,培養基已經從最基礎的天然培養基,到化學合成商用培養基,可以根據不同的需求增減營養或其它成分,他們具有不同的性能和側重點。我們只有根據所需目的,依據的標準正確選用相應的培養基,才能獲得最佳效果。


注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。

 

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