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支原體肉湯培養基的原理和使用方法

劉浩然
錄入時間:2023-4-4 9:30:38 來源:青島海博生物

一、支原體簡介

  支原體結構簡單,缺乏細胞壁,僅有質膜,胞體內有核蛋白體以及一個由環形雙鏈DNA分子組成的原核。大小僅有0.1~0.3μm,最小直徑約為100毫微米,可通過濾菌器,會干擾細胞培養等工作的進行。由于能形成絲狀與分枝形狀,故稱為支原體。

  不同支原體利用的能源物質不同,如發酵葡萄糖的肺炎支原體、人型支原體等,水解精氨酸的口腔支原體等,還有利用尿素作為能源的解脲支原體?衫冒l酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反應鑒別支原體。

  支原體營養要求一般比細菌高,除必須的基礎營養物質外,還需添加10%~20%的動物血清以提供支原體所需的膽固醇。由于大多數的支原體兼性厭氧,有些菌株在活化分離時保持5%~10%二氧化碳環境生長狀態更好。解脲支原體在厭氧條件下生長更好。

  支原體無細胞壁,對滲透壓敏感,對抑制細胞壁合成的抗生素不敏感,因此可添加青霉素抑制細菌的生長。由于滲透壓突變會導致支原體破裂死亡,因此培養支原體時,維持適宜的滲透壓顯得格外重要。此外,在支原體培養中,pH也是重要因素。


二、肺炎支原體檢驗依據及培養基原理

  支原體檢查法在2020年版《中華人民共和國藥典》中體現,要求使用支原體肉湯培養基培養監測肺炎支原體。具體操作要求為:將肺炎支原體稀釋至10-7~10-9,接種在支原體肉湯培養基中,每個稀釋度接種3支試管,置于36℃培養7-14天,觀察培養基變色結果。肺炎支原體可以發酵培養基中的葡萄糖,使培養基的pH值降低,遇指示劑酚紅使培養基變黃。

  豬胃消化粉、牛肉浸粉、酵母浸粉提供碳氮源、維生素和生長因子;葡萄糖為可發酵的糖類;氯化鈉維持滲透壓;酚紅為指示劑。


三、培養基配方(g/L)

豬胃消化粉

10.0

牛肉浸粉

5.0

酵母浸粉

5.0

氯化鈉

2.5

葡萄糖

5.0

酚紅

0.02

pH 7.6±0.2(25℃)


四、試驗方法

  1、稱取本品27.52g,加熱溶解于800mL蒸餾水中,121℃高壓滅菌15分鐘,冷至室溫,無菌操作加入滅活小牛血清或馬血清200mL和青霉素80萬單位,混勻,分裝無菌試管,備用。

  2、制備質控菌株,接種到培養基中,并梯度稀釋至-9,并做空白對照。

  3、放置于36℃±1℃恒溫培養箱中,需氧培養7-14天。


五、試驗注意事項

  1、若使用非一次性試管等容器進行試驗,容器使用前應使用蒸餾水沖洗干凈,確保無洗滌液等殘留物,以免增加試驗的不確定性或污染。

  2、滅菌結束后,試管口會有水珠,在進行梯度稀釋時,水珠很容易與空氣中的細菌接觸以致污染,因此,試管口應灼燒至干燥,膠塞也需過火,振蕩操作后,若培養基接觸到膠塞,還需再次進行灼燒管口。

  3、調節pH時,使用的酸堿試劑均應是滅菌后的。

  4、支原體培養前應使用封口膜封口,可提供微需氧環境以及降低污染的風險。


六、質控結果

  接種以下質控菌株,放置于36℃±1℃恒溫培養箱中,需氧培養7~14天。培養至12天的試驗結果如圖1所示。

質控菌株

菌株編號

接種量(CFU)

生長情況

其它特征

肺炎支原體

ATCC 15531

/

+++

10(-9)稀釋度變黃色


支原體肉湯培養肺炎支原體12天的靈敏度

圖1 支原體肉湯培養肺炎支原體12天的靈敏度


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注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。

 

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