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細胞培養基的選擇



錄入時間:2023-3-27 14:09:52 來源:網絡

一、培養基介紹

  細胞培養是生物實驗里的入門實驗也是普遍要做的實驗,但細胞培養并不容易。細胞狀態的好壞關系著后續實驗,諸如篩選藥物、轉染、提取蛋白(RNA)等的進展。影響細胞狀態的因素有很多,包括初始細胞的狀態、培養基、血清、孵箱溫度、CO2濃度等,我們先考慮培養基和血清的影響。

  一般來說,常用的培養基有很多種,其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是應用最廣泛的培養基。其他的M199、IMDM、L15等型號培養基等也用于特定細胞的培養。

  ◆ MEM是在Eagle’s基礎培養基(BME)基礎上,增加了組分的范圍及濃度改良而成的,后續產生的迭代產品大多都是在MEM培養基基礎上進行的改良。

  ◆ Dulbecco的BEM(DMEM)培養基一開始是為小鼠成纖維細胞設計的,現在常用于貼壁細胞的培養。DMEM培養基是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養基,是在MEM培養基的基礎上研制的。與MEM相比,DMEM增加了各種成分用量,同時又分為高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長,適于生長較快、附著較困難腫瘤細胞等。與最普通的MEM培養基相比,DMEM的氨基酸濃度是MEM的兩倍、且含有非必須氨基酸;維生素濃度是MEM的4倍;含有糖酵解途徑中的重要物質--丙酮酸;含有微量的鐵離子,采用雙倍的HCO3-和CO2濃度起到更好的緩沖作用。

  ◆ α MEM是最低必需培養基(MEM)的改良培養基,含有非必需氨基酸、丙酮酸鈉、硫辛酸、維生素B12、生物素和抗壞血酸。αMEM  還提供不含核苷的版本,可用作DG44和其他DHFR陰性細胞的篩選培養基。該產品由Earle’s平衡鹽制成。αMEM不含蛋白質、脂質或生長因子。因此,αMEM需要補充營養成分,通常需要添加10%胎牛血清(FBS)。αMEM使用碳酸氫鈉緩沖系統(2.2 g/L),因此需要5–10% CO2的環境來維持生理pH值。alpha-MEM培養基中的成分也比MEM要多很多,常被用來培養比較難培養的細胞。

  ◆ DMEM/F12培養基適于克隆密度的培養。F12培養基成分復雜,含有多種微量元素,和DMEM以1:1結合,稱為DMEM/F12培養基(DME/F12medium),作為開發無血清配方的基礎,以利用F12含有較豐富的成分和DMEM含有較高濃度的營養成分為優點。該培養基適用于血清含量較低條件下哺乳動物細胞培養。為了增強該培養基的緩沖能力,改良之一是在DMEM/F12(1:1)中加入15mMHEPES緩沖液。

  ◆ Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培養基被發現適用于多種哺乳動物細胞,包括HeLa細胞、Jurkat細胞、MCF-7細胞、PC12細胞、PBMC細胞、星形膠質細胞和癌細胞。RPMI 1640培養基相比其他培養基具有獨特的效果,其中含有還原劑谷胱甘肽和高濃度的維生素。RPMI 1640培養基含有生物素、 維生素B12以及PABA,這些成分是Eagle’s MEM和DMEM所不具備的。

  培養基的種類繁多,那么對于某種細胞應該用哪種培養基呢?其實這個問題的答案要根據細胞來定。如果這種細胞是購自ATCC或其他的細胞庫,可以直接詢問供應商,獲取相應的實驗參數;蛘哒业绞褂孟鄳毎膮⒖嘉墨I,借鑒他人的經驗;蛘呓柚鱾網站的系統工具,像Invitrogen網站上有一個Cell Line Database的工具,可以選擇細胞類型,系統會推薦合適的培養基、血清和轉染試劑等。再比如Sigma網站上也有一個Media Expert的工具,包括了培養基所有成分的功能描述、使用推薦和參考文獻等,對于細胞培養中的常見問題,如細胞貼壁不好、培養基變色等,Media Expert都有列出可能的原因,并提供補救辦法。

  但如果是全新細胞的培養體系,找不到參考文獻或者技術支持,那就需要慢慢摸索合適的條件了。因為對于不同的細胞沒有一個“放之四海而皆準”的條件。但大體上可以先用MEM做貼壁細胞培養、RPMI 1640做懸浮細胞培養嘗試一下。也可以購買幾種培養基,做一個簡單的細胞生長實驗,選擇生長狀態最好的條件;蛟S摸出的最佳培養條件與文獻報道的不同,就算是同一種培養條件,細胞的生長狀態也時好時壞,這是很正常的。因為試劑、水、不同批號的血清之間都存在著差異,為了保證實驗結果的準確性,這就要提高培養基的穩定性,可以從培養基和血清兩方面入手。

  以前大部分實驗室用的干粉培養基,是需要自己配制的。但配制過程就較為繁瑣,需要溶解干粉、調節溶液的pH值,過濾雜質,一旦過程中有一點小誤差,那培養基的穩定性或許就被破壞了。而且有些實驗室的水質也是一個問題,不好的水可能會使培養基不能養活細胞甚至染菌,所以培養的效果會有差異,F在大多使用成品的液體培養基,這樣人為的誤差就可以減少,因為機器大批量工業化生產的,相比人為稱量配制的培養基批間差會小很多。

  說完培養基我們來說血清。血清是指血液凝固后,在血漿中除去纖維蛋白原及某些凝血因子后分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白原已被除去的血漿。其主要作用是:

  ① 提供基本營養物質,氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等,是細胞生長必須的物質。

  ② 提供激素和各種生長因子。血清中含有生長因子可促進細胞的繁殖,含有附著因子可促進細胞的貼壁,同時還具有抗胰酶活性。

  ③ 提供結合蛋白,結合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質,如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等,轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。

  ④ 提供促接觸和生長因子使細胞貼壁免受機械損傷、對培養中的細胞起到某些保護作用。

可用于細胞實驗的血清有胎牛血清、透析型胎牛血清 、天然低IGG胎牛血清 、干細胞培養胎牛血清 、特殊用途胎牛血清 、活性炭/葡萄糖處理胎牛血清 、胎牛血清替代物 、小牛血清 、新生牛血清 、加強型小牛血清 、補鐵小牛血清 、成牛血清 、供體馬血清 、兔血清 、雞血清 、豬血清 、馬血清 、其他動物血清及合成血清替代品等。其中最常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清等。牛血清是按照采血時間的早晚來分類的。采血時間越早,營養物質越豐富,所含抗體也越少,因而胎牛血清適合要求高的細胞系和克隆化培養。由于瘋牛病的原因,到目前為止,我國政府仍然禁止從北美洲、歐洲和日本等地區進口牛血清,因此市面上的牛血清大多來自澳洲、南美洲,或是國產的。

  血清是由血漿去除纖維蛋白原而形成的一種很復雜的混合物,其組成成份雖大部分已知,但還有一部分尚不清楚,且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。血清都是批量生產,各批量之間差異很大,而且血清保存期至多一年,這就造成了不同批次血清之間的差異。這種差異來源于不同的制備方法和除菌方法、動物的年齡差別及血清的儲存條件等,而且與取血動物的來源關系密切。不同的牧場、不同的氣候天氣及其他環境因素都可能影響血清的質量。因此,要保證每批血清的相似性極為困難,從而使實驗的標準化和連續性受到限制;當選好了一種血清就要盡可能長期使用它。在需要更換時,也要盡量保持與原有的一批血清相似,F在很多公司都提供血清預留,一旦選定了某個批次的血清,最好備足一年的量,這樣可以避免很多麻煩。

  血清固然是細胞培養中不可或缺的成分,但血清的批間差異大,更換血清時需要做大量的測試以取保替換的血清與原來的相似。因此,也有一些實驗室開始換用無血清培養基。

  無血清培養基(Serum-Free Media),通常以SFM表示,顧名思義,就是在細胞培養中不需要添加血清,但是在某些應用中可能要添加生長因子或細胞因子。無血清培養基中添加了血清的主要成分:粘附因子、生長因子、必需的營養物質和激素等,能減少血清帶來的不利因素,使細胞培養的條件更穩定。經歷了天然培養基、合成培養基后,無血清培養基和無血清培養成為當今細胞培養領域的一大趨勢。采用無血清培養可簡化純化和鑒定各種細胞產物的程序,避免病毒污染造成的危害。但它也有一些缺點,從有血清培養過渡到無血清培養的條件并不像想象中那么簡單。處于發育的不同分化階段的細胞(例如干細胞與定向前體細胞相比)需要不同的配方,對生長因子和細胞因子的選擇尤為重要。而且在去除血清的同時,也去除了一些血清蛋白具有的保護、解毒作用,因此對試劑、水的純度和儀器清潔度的要求更高。細胞在無血清培養基中易受某些機械因素和化學因素的影響,培養基的保存和應用不如傳統的合成培養基方便。另外,它的價格也比普通的培養基貴很多。

  現在有很多廠家生產無血清培養基。GIBCO這個細胞培養的金字招牌當然少不了,它也是最早研制無血清培養基的。目前已經開發了ES細胞、雜交瘤、CHO、293、昆蟲細胞、神經細胞、淋巴細胞、角質細胞、內皮細胞等多種細胞的無血清培養基。上個月還推出了首個間充質干細胞的無血清培養基,能使MSC維持未分化狀態超過9代。HyClone公司也有CHO、293、雜交瘤細胞、昆蟲細胞、病毒疫苗細胞的多種無血清培養基。Sigma則剛剛收購了澳大利亞JRH公司,有了JRH的EX-CELL系列,無血清培養基的選擇也更多了。

  但不管是新興的無血清培養基還是傳統的有血清培養基,都有其相應的優缺點,選擇合適自己細胞培養的條件,并且盡可能保證實驗的穩定才是最重要的。


二、注意事項(摘自Invitrogen的中文Focus)

  1. 細胞培養基的儲存條件應為2-8℃。如果細胞培養基不小心被凍,應該融化培養基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生,培養基可以正常使用,如果出現沉淀,應更換培養基。

  2. 貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基,可能在放置一段時間后顏色變紫。這是由于暴露到周圍的CO2水平時,碳酸氫納導致了pH值的上升?梢栽谑褂们八砷_瓶口,在CO2培養箱孵育培養基10-15分鐘,來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。

  3. 當在無血清培養基中添加抗生素時,降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。正常有血清的培養基,血清蛋白會結合、滅活一些抗生素。但在無血清培養條件下,抗生素不被滅活,這可能對于細胞達到毒性水平。

  4. 一旦在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

  5. 大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會影響它的性能。

  6. 血清的熱滅活在免疫分析時可以滅活補體系統。在免疫學研究,培養ES細胞,昆蟲細胞和平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。熱滅活是以往公認的操作步驟,并沒有確鑿的證據說明這樣做是有益的。相反,對大部分細胞而言,GIBCO和HyClone都不推薦熱滅活血清。因為加熱可能使血清中的沉淀增加,或許會誤以為污染。

  7. 在進行傳代培養時,推薦進行臺盼蘭活性記數。研究者常常通過一個簡單的稀釋(1∶4或1∶2)進行傳代,不進行活性檢測,可能實際存活的細胞傳代濃度要遠遠低于以為的濃度,這可能導致生長緩慢或培養物根本不生長。

  8. 貯存在4℃冰箱中的胰蛋白酶溶液只能使用一周。因為胰蛋白酶在4℃就可能開始降解,如果在室溫下放置超過30分鐘,就會變得不穩定。

  9. 如果是細胞庫內購買的細胞,在訂購的細胞到達后,應立即復蘇,如果培養基還沒有準備好,可將其放入液氮中,仍需盡快復蘇。切記不能放置在-20或-80℃的冰箱內。


三、如何避免血清中沉淀物的產生

  1. 解凍血清時,請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫),若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃),實驗顯示非常容易產生沉淀物。并隨時將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發生。

  2. 請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清會變得混濁,同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害,而影響血清的質量。

  3. 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無須做此步驟。若必須做血清的熱滅活,請遵守56℃,30分鐘的原則,并且隨時搖晃均勻。溫度過高,時間過久或搖晃不均勻,都會造成沉淀物的增多。


來源:天然活性產物發現與靶標鑒定公眾號

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