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樣品中大腸埃希氏菌的分離方法解讀

許英俊
錄入時間:2023-3-22 14:34:20 來源:青島海博生物

一、簡介

  大腸埃希氏菌(Escherichia coli),又叫大腸桿菌,是條件致,在人體飲食不當或免疫力下降的時候可以引起胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染,患者容易出現腹瀉、腹痛、發燒等臨床表現。

  為了幫助更好地理解本文的操作,此處需要特別明確一下:大腸菌群并非細菌學分類命名,而是衛生細菌領域的用語,它不代表某一個或某一屬細菌,而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌,這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致,其定義為:需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群主要包括中希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。

  《GB4789.38  食品安全國家標準  食品微生物學檢驗  大腸埃希氏菌計數》中,有關大腸埃希氏菌的計數共涉及兩種方法,MPN法和平板法,其中MPN法中對大腸埃希氏菌的分離主要分為三個步驟:初發酵試驗、復發酵試驗和平板分離試驗(如圖1)。

  相關標準:GB 4789.38-2012 大腸埃希氏菌計數 -點擊查看下載

  本文主要對這些分離步驟進行解讀和探討。

大腸埃希氏菌MPN計數法檢驗程序

圖1 大腸埃希氏菌MPN計數法檢驗程序


二、培養基的選擇與比較

  為了有效分離出樣品中的大腸埃希氏菌,標準中共選用了三種培養基,LST肉湯、EC肉湯和EMB瓊脂。下面對這三種培養基全面進行比較(如表1)。

表1 大腸埃希氏菌分離用三種培養基的比較

比較

項目

液體發酵培養基

平板分離培養基

初發酵

復發酵

劃線平板

名稱

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST肉湯)

EC肉湯

EMB瓊脂

貨號

HB0102(干粉)

HB0105(干粉)

HB0107(干粉)

HBKD0102/

HBKP0102(顆粒)

HBKD0105/

HBKP0105(顆粒)

HBKP0107(顆粒)

HBPT017(即用型試管)

HBPT020-1(即用型試管)

HBPM007(即用型平皿)

用途

用于大腸菌群、

大腸桿菌的測定

用于糞大腸菌群、

大腸桿菌的測定

用于分離腸道致病菌,

特別是大腸桿菌

配方(g/L)

胰蛋白胨

20.0

氯化鈉

5.0

乳糖

5.0

磷酸氫二鉀

2.75

磷酸二氫鉀

2.75

月桂基硫酸鈉

0.1

pH值6.8±0.2

25℃

胰蛋白胨

20.0

乳糖

5.0

氯化鈉

5.0

磷酸氫二

4.0

磷酸二氫鉀

1.5

三號膽鹽

1.5

pH值6.9±0.1

25℃

蛋白胨

10.0

乳糖

10.0

磷酸氫二鉀

2.0

瓊脂

15.0

伊紅

0.4

美藍

0.065

pH值7.1±0.2

25℃

原理

乳糖提供菌體細胞生長所需要的碳源;月桂基硫酸鈉抑制非大腸菌群類細菌的生長。

乳糖是可發酵的糖類;3號膽鹽抑制革蘭氏陽性菌,特別抑制革蘭氏陽性桿菌和糞腸球菌。

乳糖作為可發酵的碳源;伊紅和美藍同時作為抑制劑和指示劑,在酸性條件下產生沉淀,形成具黑色中心有金屬光澤或無光澤的菌落。

接種量

1mL

1環

/

培養溫度

36℃±1℃

44.5℃±0.2℃

36℃±1℃

培養時間

24h-48h

24h-48h

18h-24h

陽性菌特征

渾濁度2,且氣體充滿管內1/3

渾濁度2,且氣體充滿管內1/3

黑色菌落,有金屬光澤

排除菌

革蘭氏陽性菌(糞腸球菌、金黃色葡萄球菌):抑制;沙門氏菌:生長,但不產氣

革蘭氏陽性菌(糞腸球菌、金黃色葡萄球菌):抑制;沙門氏菌-生長,但不產氣;非大腸埃希氏菌的大菌群其它種類(檸檬酸桿菌、腸桿菌、克雷伯氏菌)-生長,但不產氣

革蘭氏陽性菌(糞腸球菌、金黃色葡萄球菌)-抑制;沙門氏菌-無色菌落;非大腸埃希氏菌的大菌群其它種類(檸檬酸桿菌、腸桿菌、克雷伯氏菌)-粉紅色菌落,無金屬光澤

可疑菌

大腸菌群(大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、腸桿菌、產氣克雷伯氏菌)

大腸埃希氏菌

大腸埃希氏菌


三、程序解讀和結果判斷

  從表中可以清晰地看出:該程序就是通過使用LST培養,將革蘭氏陽性菌抑制住,并將非大腸菌群的其他細菌排除掉,有目的地篩選出大腸菌群細菌;然后通過使用EC肉湯培養,抑制革蘭氏陽性細菌的同時,通過產氣特征,進一步從大腸菌群中篩選出大腸埃希氏菌;然后將含有大量大腸埃希氏菌和少量雜菌的菌液進行EMB平板劃線,徹底將大腸埃希氏菌培養成單菌落,通過菌落特征進行有效識別,方便后期進一步挑選、純化和鑒定。

  三個步驟中所用的培養基都能有效抑制革蘭氏陽性菌的生長,所以完全不用擔心這類細菌的干擾。

  不同菌種在這三種培養基上的生長情況如圖2所示:

圖2-1 LST肉湯培養不同菌株的試驗結果(渾濁且產氣的為大腸菌群)

圖2-1 LST肉湯培養不同菌株的試驗結果(渾濁且產氣的為大腸菌群)

EC肉湯培養不同菌株的結果(渾濁產氣的為大腸埃希氏菌)

圖2-2 EC肉湯培養不同菌株的結果(渾濁產氣的為大腸埃希氏菌)

EMB培養不同菌株的試驗結果(菌落黑色且有金屬光澤的為大腸埃希氏菌)

圖2-3 EMB培養不同菌株的試驗結果(菌落黑色且有金屬光澤的為大腸埃希氏菌)


四、后續試驗

  通過逐步分離,形成的典型大腸埃希氏菌單菌落,并不能判定為就一定是大腸埃希氏菌,還需要將這些單菌落進一步純化,進行后續的生化鑒定試驗,才能最終確定是否為大腸埃希氏菌。


相關標準:

GB 4789.38-2012 大腸埃希氏菌計數 -點擊標準下載


相關產品:

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)-點擊查看產品詳情

EC肉湯-點擊查看產品詳情

伊紅美藍瓊脂(EMB)-點擊查看產品詳情

注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。

 

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