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金黃色葡萄球菌檢驗方法-化妝品安全技術規范(2022年版)



錄入時間:2022-11-29 14:21:40 來源:2022年版化妝品安全技術規范

1.范圍

  本規范規定了化妝品中金黃金色葡萄球菌的檢驗方法。

  本規范適用于化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗。

 

2.定義

  2.1 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus

  為革蘭氏陽性球菌,呈葡萄狀排列,無芽胞,無莢膜,能分解甘露醇,血漿凝固酶陽性。

 

3.儀器和設備

  3.1 顯微鏡。

  3.2 恒溫培養箱:36℃±1℃。

  3.3 離心機。

  3.4 滅菌刻度吸管:10mL、 1mL。

  3.5 試管:18 mm×150mm。

  3.6 載玻片。

  3.7 酒精燈。

  3.8 三角瓶:250mL。

  3.9 高壓滅菌器。

  3.10 恒溫水浴箱。

 

4.培養基和試劑

  4.1 SCDLP 液體培養基

  見總則中 3.2。

  4.2 營養肉湯

  成分:
蛋白胨       
10g

牛肉膏
3g

氯化鈉
5g

蒸餾水
加至1000mL
  制法:將上述成分加熱溶解,調pH7.4,分裝,121℃高壓滅菌15min。

  4.3 7.5%氯化鈉肉湯

  成分:
蛋白胨       
10g

牛肉膏
3g

氯化鈉
75g

蒸餾水
加至1000mL
  制法:將上述成分加熱溶解,調pH7.4,分裝,121℃高壓滅菌15min。

  4.4 Baird Parker平板

  成分:
胰蛋白胨
10g

牛肉膏
5g

酵母浸膏
1g

丙酮酸鈉
10g

甘氨酸
12g

氯化鋰(LiCI·6H2O)
5g

瓊脂
20g

蒸餾水
950mL

pH
7.0±0.2
  增菌劑的配制:30%卵黃鹽水50mL與除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合,保存于冰箱內。

  制法:將各成分加到蒸餾水中,加熱煮沸完全溶解,冷至25℃±1℃,調節pH。分裝每瓶95mL,121℃高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂,冷至50℃,每95mL加入預熱至50℃左右的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL,搖勻后傾注平板。培養基應是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過48h±2h。

  4.5 血瓊脂平板

  成分:
營養瓊脂
100mL

脫纖維羊血(或兔血)
10mL
  制法:將營養瓊脂加熱融化,待冷至50℃左右無菌操作加入脫纖維羊血,搖勻,制成平板,置冰箱內備用。

  4.6 甘露醇發酵培養基

  成分
蛋白胨
10g

氯化鈉
5g

甘露醇
10g

牛肉膏
5g

0.2%麝香草酚藍溶液
12mL

蒸餾水
1000mL
  制法:將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中,加熱溶解,調pH7.4,加入甘露醇和指示劑,混勻后分裝試管中,68.95kPa (115℃ 101b20min滅菌備用。

  4.7 滅菌液體石蠟

  見總則中3.3。

  4.8 兔(人)血漿制備

  取3.8%檸檬酸鈉溶液,121℃高壓滅菌30min,1份加兔(人)全血4份,混勻靜置;2000rpm3000rpm離心3min~5min。血球下沉,取上面血漿。

 

5.操作步驟

  5.1 增菌:1:10稀釋的檢液10mL接種到90mL SCDLP液體培養基中,置36℃±1℃培養箱,培養24h±2h。

  注:如無此培養基也可用7.5%氯化鈉肉湯。

  5.2 分離:自上述增菌培養液中,取12接種環,劃線接種到Baird Parker平板上,如無此培養基也可劃線接種到血瓊脂平板上,置.36℃±1℃培養48h±2h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色,圓形,不透明,表面光滑,周圍有溶血圈。在Baird Parker平板培養基上為圓形,光滑,凸起,濕潤,顏色呈灰色到黑色,邊緣為淡色,周圍為一混濁帶,在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落,但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上,置36℃±1℃培養24h±2h。

  5.3 染色鏡檢:挑取血瓊脂平板上分純后的菌落,涂片,進行革蘭氏染色,鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌,排列成葡萄狀,無芽胞,無莢膜,致病性葡萄球菌,菌體較小,直徑約為0.5um~1um。

  5.4 甘露醇發酵試驗:取血瓊脂平板上分純后的菌落接種到甘露醇發酵培養基中,在培養基液面上加入高度為2mm~3mm 的滅菌液體石蠟,置36℃±1℃培養24h±2h,金黃色葡萄球菌應能發酵甘露醇產酸。

  5.5 血漿凝固酶試驗:吸取1:4新鮮血漿0.5mL,置于滅菌小試管中,加入待檢菌24h±2h營養肉湯培養物0.5mL,混勻,置36℃±1℃恒溫箱或恒溫水浴中,每半小時觀察一次,6h之內如呈現凝塊即為陽性。同時將已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株的營養肉湯培養物及營養肉湯培養基各0.5mL,分別加入無菌1:4血漿0.5mL,混勻,作為對照。也可使用商品化試劑,按照說明書操作,進行血漿凝固酶試驗。

 

6.檢驗結果報告

  凡在上述分離平板上有可疑菌落生長,經染色鏡檢,證實為革蘭氏陽性葡萄球菌,并能發酵甘露醇產酸,血漿凝固酶試驗陽性者,可報告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。

 

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