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銅綠假單胞菌檢驗方法-化妝品安全技術規范(2022年版)



錄入時間:2022-11-29 13:56:58 來源:2022年版化妝品安全技術規范

1.范圍

  本規范規定了化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗方法。

  本規范適用于化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗。

 

2.定義

  2.1銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa

  屬于假單胞菌屬,為革蘭氏陰性桿菌,氧化酶陽性,大部分能產生綠膿菌素。

 

3.儀器

  3.1 恒溫培養箱:36℃±1℃、42℃±1℃。

  3.2 三角瓶:250mL。

  3.3 試管:18 mm×150mm。

  3.4 滅菌平皿:直徑90mm。

  3.5 滅菌刻度吸管:10mL、 1mL。

  3.6 顯微鏡。

  3.7 載玻片。

  3.8 接種針、接種環。

  3.9 電磁爐。

  3.10 高壓滅菌器。

  3.11 恒溫水浴箱。

 

4.培養基和試劑

  4.1 SCDLP液體培養基

  見總則中3.2。

  4.2 十六烷基三甲基溴化銨培養基

  成分:
    牛肉膏
3g

    蛋白胨
10g

    氯化鈉
5g

    十六烷基三甲基溴化銨
0.3g

    瓊脂
20g

    蒸餾水
1000mL
  制法:除瓊脂外,將上述成分混合加熱溶解,調pH7.4~7.6,加入瓊脂,115℃高壓滅菌20min后,制成平板備用。

  4.3 乙酰胺培養基

  成分:
    乙酰胺
10.0g

    氯化鈉
5.0g

    無水磷酸氫二鉀
1.39g

    無水磷酸二氫鉀
0.73g

    硫酸鎂(MgSO4.7H2O)
0.5g

    酚紅
0.012g

    瓊脂
20g

    蒸餾水
1000mL

  制法:除瓊脂和酚紅外,將其他成分加到蒸餾水中,加熱溶解,調pH7.2,加入瓊脂、酚紅,121℃高壓滅菌20min后,制成平板備用。

  4.4 綠膿菌素測定用培養基

  成分: 蛋白胨
20g

氯化鎂
1.4g

硫酸鉀
10g

瓊脂
18g

甘油(化學純)
10g

蒸餾水
1000mL
  制法:將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中,加熱使其溶解,調pH7.4,加入瓊脂和甘油,加熱溶解,分裝于試管內,115℃高壓滅菌20min后,制成斜面備用。

  4.5 明膠培養基

  成分:
牛肉膏    
3g

蛋白胨
5g

明膠
120g

蒸餾水
1000mL
  制法:取各成分加到蒸餾水中浸泡20min,隨時攪拌加熱使之溶解,調pH7.4,分裝于試管內,經115℃高壓滅菌20min后,直立制成高層備用。

  4.6 硝酸鹽蛋白胨水培養基

  成分:
蛋白胨   
10g

酵母浸膏  
3g

硝酸鉀
2g

亞硝酸鈉
0.5g

蒸餾水
1000mL

  制法:將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中,加熱使之溶解,調pH7.2,煮沸過濾后補足液量,加入硝酸鉀和亞硝酸鈉,溶解混勻,分裝到加有小倒管的試管中,115℃高壓滅菌20min后備用。

  4.7 普通瓊脂斜面培養基

  成分:
蛋白胨   
10g

牛肉膏
3g

氯化鈉
5g

瓊脂
15g

蒸餾水
1000mL
  制法:除瓊脂外,將其余成分溶解于蒸餾水中,調pH7.2~7.4,加入瓊脂,加熱溶解,分裝試管,121℃高壓滅菌20min后,制成斜面備用。

 

5操作步驟

  5.1 增菌培養:1:10檢液10mL加到90mL SCDLP液體培養基中,36℃±1℃培養18h~24h。如有銅綠假單胞菌生長,培養液表面多有一層薄菌膜,培養液常呈黃綠色或藍綠色。

  5.2 分離培養:將增菌后的培養物,劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上,置36℃±1℃培養18h~24h。凡銅綠假單胞菌在此培養基上,其菌落扁平無定型,向周邊擴散或略有蔓延,表面濕潤,菌落呈灰白色,菌落周圍培養基常擴散有水溶性色素。

  在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時也可用乙酰胺培養基進行分離,將增菌后的培養物劃線接種于平板上,置36℃±1℃培養24h±2h,銅綠假單胞菌在此培養基上生長良好,菌落扁平,邊緣不整,菌落周圍培養基呈紅色,其他菌不生長。

  5.3 染色鏡檢:挑取可疑的菌落,涂片,革蘭氏染色(見耐熱大腸菌群檢驗方法4.5.2),鏡檢為革蘭氏陰性者應進行氧化酶試驗。

  5.4 氧化酶試驗:取一小塊潔凈的白色濾紙片置于滅菌平皿內,用無菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙片上,然后在其上滴加一滴新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液,在15s~30s之內,出現粉紅色或紫紅色時,為氧化酶試驗陽性;若培養物不變色,為氧化酶試驗陰性。

  5.5 綠膿菌素試驗:取可疑菌落2~3個,分別接種在綠膿菌素測定用培養基上,置36℃±1℃培養24h±2h,加入三氯甲烷3mL~5mL,充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解于三氯甲烷液內,待三氯甲烷提取液呈藍色時,用吸管將三氯甲烷移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右,振蕩后,靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性,表示被檢物中有綠膿菌素存在。

  5.6 硝酸鹽還原產氣試驗:挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物,接種在硝酸鹽胨水培養基中,置36℃±1℃培養 24h±2h,觀察結果。凡在硝酸鹽胨水培養基內的小倒管中有氣體者,即為陽性,表明該菌能還原硝酸鹽,并將亞硝酸鹽分解產生氮氣。

  5.7 明膠液化試驗:挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物,穿刺接種在明膠培養基內,置36℃±1℃培養24h±2h,取出放置于4℃±2℃冰箱10min~30min,如仍呈溶液狀或表面液化時即為明膠液化試驗陽性;如凝固不溶者為陰性。

  5.8 42℃生長試驗:挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物,接種在普通瓊脂斜面培養基上,置于42℃±1℃培養箱中,培養24h~48h,銅綠假單胞菌能生長,為陽性,而近似的熒光假單胞菌則不能生長。

 

6.檢驗結果報告

  被檢樣品經增菌分離培養后,平板上有可疑菌落,并經證實為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性,即可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌;如綠膿菌素試驗陰性而明膠液化、硝酸鹽還原產氣和 42℃生長試驗三者皆為陽性時,仍可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。

 

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