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耐熱大腸菌群檢驗方法-化妝品安全技術規范(2022年版)



錄入時間:2022-11-28 10:21:28 來源:2022年版化妝品安全技術規范

1.范圍

  本規范規定了化妝品中耐熱大腸菌群的檢驗方法。

  本規范適用于化妝品中耐熱大腸菌群的檢驗。


2.定義

  2.1 耐熱大腸菌群 Thermotolerant coliform bacteria

  系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌,在44.5℃培養24h~48h能發酵乳糖產酸并產氣。

  該菌主要來自人和溫血動物糞便,可作為糞便污染指標來評價化妝品的衛生質量,推斷化妝品中有否污染腸道致病菌的可能。


3.儀器

  3.1 恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱:44.5℃±0.5℃。

  3.2 溫度計。

  3.3 顯微鏡。

  3.4 載玻片。

  3.5 接種環。

  3.6 電磁爐。

  3.7 三角瓶:250mL。

  3.8 試管: 18 mm×150mm。

  3.9 小倒管。

  3.10 pH計或pH試紙。

  3.11 高壓滅菌器。

  3.12 滅菌刻度吸管:10mL、1mL。

  3.13 滅菌平皿:直徑90mm。


4.培養基和試劑

  4.1 雙倍乳糖膽鹽(含中和劑)培養基

  成分:
蛋白胨
40g

豬膽鹽
10g

乳糖
10g

0.4%溴甲酚紫水溶液
5mL

卵磷脂
2g

吐溫80
14g

蒸餾水
1000mL
  制法:將卵磷脂、吐溫80溶解到少量蒸餾水中。將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解到其余的蒸餾水中,加到一起混勻,調pH為7.4,加入0.4%溴甲酚紫水溶液,混勻,分裝試管,每管10mL(每支試管中加一個小倒管)。115℃高壓滅菌20min。

  4.2 伊紅美藍(EMB)瓊脂

  成分:
蛋白胨
10g

乳糖
10g

磷酸氫二鉀
2g

瓊脂
20g

2%伊紅水溶液
20mL

0.5%美藍水溶液
13mL

蒸餾水
1000mL

  制法:先將瓊脂加到900mL蒸餾水中,加熱溶解,然后加入磷酸氫二鉀和蛋白胨,混勻,使之溶解。再以蒸餾水補足至1000mL。調pH值為7.2~7.4,分裝于三角瓶內,121℃高壓滅菌15min備用。使用前將瓊脂融化,于每100mL瓊脂中無菌操作加入5mL滅菌的20%乳糖溶液、2mL2%伊紅水溶液和1.3mL 0.5%美藍水溶液,搖勻,冷至45℃~50℃,傾注平皿備用。

  4.3 蛋白胨水(靛基質試驗用)

  成分:
蛋白胨(或胰蛋白胨)
20g

氯化鈉
5g

蒸餾水
1000mL
  制法:將上述成分加熱融化,調pH值為7.0~7.2,分裝小試管,121℃高壓滅菌15min。

  4.4 靛基質試劑

  柯凡克試劑:將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中,然后緩慢加入濃鹽酸25mL。

  試驗方法:接種細菌于蛋白胨水中,于44.5℃土0.5℃培養24h±2h。沿管壁加柯凡克試劑0.3mL~0.5mL,輕搖試管。陽性者于試劑層顯深玫瑰紅色。

  注:蛋白胨應含有豐富的色氨酸,每批蛋白胨買來后,應先用已知菌種鑒定后方可使用。

  4.5 革蘭氏染色液:

  4.5.1 染液制備

  4.5.1.1 結晶紫染色液:

  成分:
結晶紫
1g

95%乙醇
20mL

1%草酸銨水溶液
80mL
  將結晶紫溶于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。

  4.5.1.2 革蘭氏碘液:

  成分:

1g

碘化鉀
2g

蒸餾水加至
300mL
  將碘與碘化鉀先進行混合,加入蒸餾水少許,充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至300mL。

  4.5.1.3 脫色液:95%乙醇。

  4.5.1.4 復染液:

  (1)沙黃復染液:

  成分:
沙黃
0.25g

95%乙醇
10mL

蒸餾水
90mL

  將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。

  (2)稀石碳酸復紅液:稱取堿性復紅10g,研細,加95%乙醇100mL,放置過夜,濾紙過濾。取該液10mL,加5%石碳酸水溶液90mL混合,即為石碳酸復紅液。再取此液10mL加水90mL,即為稀石碳酸復紅液。

  4.5.2 染色法

  4.5.2.1 將涂片在火焰上固定,滴加結晶紫染色液,染1min,水洗。

  4.5.2.2 滴加革蘭氏碘液,作用1min,水洗。

  4.5.2.3 滴加95%乙醇脫色,約30s,或將乙醇滴滿整個涂片,立即傾去,再用乙醇滴滿整個涂片,脫色10s,水洗。

  4.5.2.4 滴加復染液,復染1min,水洗,待干,鏡檢。

  4.5.3 染色結果

  革蘭氏陽性菌呈紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色。

  注:如用1:10稀釋石碳酸復紅染色液作復染,復染時間僅需10s。


5.操作步驟

  5.1 取10mL 1:10稀釋的檢液,加到10mL雙倍乳糖膽鹽(含中和劑)培養基中,置44.5℃±0.5℃培養箱中培養24h±2h,如既不產酸也不產氣,繼續培養至48h±2h,如仍既不產酸也不產氣,則報告為耐熱大腸菌群陰性。

  5.2 如產酸產氣,劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上,置36℃±1℃培養18h~24h。同時取該培養液1~2滴接種到蛋白胨水中,置44.5℃±0.5℃培養24h±2h。

經培養后,在上述平板上觀察有無典型菌落生長。耐熱大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養基上的典型菌落呈深紫黑色,圓形,邊緣整齊,表面光滑濕潤,常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色,不帶或略帶金屬光澤;或粉紫色、中心較深的菌落,亦常為耐熱大腸菌群,應注意挑選。

  5.3 挑取上述可疑菌落,涂片作革蘭氏染色鏡檢。

  5.4 在蛋白胨水培養液中,加入靛基質試劑約0.5mL,觀察靛基質反應。陽性反應液面呈玫瑰紅色;陰性反應液面呈試劑本色。


6.檢驗結果報告

  經上述檢驗步驟,若發酵乳糖產酸產氣,平板上有典型菌落,并經證實為革蘭氏陰性無芽胞短桿菌,靛基質試驗陽性,則可報告被檢樣品中檢出耐熱大腸菌群。

 

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