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洋蔥伯克霍爾德菌檢驗方法及結果判斷

張輝
錄入時間:2022-11-10 14:47:33 來源:青島海博生物

一、洋蔥伯克霍爾德菌簡介

  洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)(1950年Burkholder首次自洋蔥根部分離)因引起洋蔥腐爛而得名,原歸類假單胞菌屬,定名為洋蔥假單胞菌。1992年,Yabuuchi等正式將該菌與類鼻疽伯克霍爾德菌、唐菖蒲伯克霍爾德菌、皮氏伯克霍爾德菌和鼻疽伯克霍爾德菌等歸為一個新屬,即伯克霍爾德菌屬。該菌在醫院環境中廣泛存在,尤其在囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)和慢性肉芽腫。╟hronic granulomatous disease,CGD)患者痰液中易分離到。目前國內外研究資料提示該菌臨床分離率不斷增加,且對現有的抗菌藥物具有較高的耐藥性。

  洋蔥伯克霍爾德菌是一種帶尾絲革蘭陰性桿菌,在血平板上菌落呈淡黃色,濕潤、凸起、渾濁,不溶血;麥康凱平板上為乳糖不發酵菌落,細小而清晰,延長培養48h后中心呈粉紅色。


二、參考標準

  《SN/T 4684-2016 進出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌檢驗方法》


三、檢驗程序

  洋蔥伯克霍爾德菌檢驗程序見圖1。

圖1 洋蔥伯克霍爾德菌檢驗程序


四、操作步驟和結果判斷

4.1 增菌培養

  按照GB 7918.1方法制備1:10化妝品稀釋液,取稀釋液10mL加到90mL含多粘菌素B的SCDLP增菌液中,于36℃±1℃培養24h,移取1mL,轉種于10mL含慶大霉素的BCSA增菌液內,于36℃±1℃培養18 h~24 h。

  含多粘菌素B的SCDLP增菌液原理:酪蛋白胨和大豆蛋白胨提供微生物生長所需的氮源、維生素和生長因子;氯化鈉維持均衡的滲透壓;磷酸氫二鉀為培養基pH的緩沖劑;葡萄糖為可發酵的糖類;卵磷脂和吐溫80能中和防腐劑,并能起到在乳濁液中分散物質的功能,卵磷脂能中和季銨鹽,吐溫80可中和酚、六氯酚、福爾馬林,兩者結合可中和乙醇;多粘菌素B可抑制銅綠假單胞菌和其他伯克霍爾德菌生長。

  用法:稱取本品31.0g,另取吐溫80 7.0g加熱溶解于1000mL蒸餾水中,分裝,121℃高壓滅菌20分鐘,冷卻,使用前,按每100mL培養基中加入過濾除菌的多粘菌素B 25000U,混勻,備用。

  洋蔥伯克霍爾德菌在含多粘菌素B的SCDLP增菌液中生長良好,結果如圖2所示:

圖2 在含多粘菌素B的SCDLP增菌液中的生長情況

  含慶大霉素的BCSA增菌液原理:酪蛋白胨、酵母提取物提供細菌生長的基本營養;氯化鈉維持滲透壓;慶大霉素為廣譜抗生素,對多數假單胞菌屬、變形桿菌屬、大腸菌群、葡萄球菌屬、需氧芽孢桿菌屬等多種革蘭氏陰陽性菌有較強的抗菌活性,結晶紫主要抑制革蘭氏陽性菌和念珠菌的生長;乳糖和蔗糖為可發酵碳源;酚紅為酸堿指示劑,洋蔥伯克霍爾德氏菌可氧化發酵蔗糖產少量酸,不發酵乳糖,生長時培養基微變黃色。

  用法:稱取本品36.58g,加熱煮沸,完全溶解于1000mL蒸餾水中,分裝三角瓶或試管,115℃高壓滅菌15分鐘,使用前,按每100mL培養基中加入過濾除菌的慶大霉素1mg,混勻,備用。

  洋蔥伯克霍爾德菌在含慶大霉素的BCSA增菌液中生長良好,結果如圖3所示:

圖3 在含慶大霉素的BCSA增菌液中的生長情況

4.2 分離培養

  分別用接種環取BCSA增菌液一環,劃線接種于BCSA瓊脂(含多粘菌素B、慶大霉素)平板和麥康凱瓊脂(含多粘菌素B、慶大霉素)平板,于32℃±1℃培養48 h,觀察各個平板上生長的菌落。

  含多粘菌素B、慶大霉素的BCSA瓊脂原理:酪蛋白胨、酵母提取物提供細菌生長的基本營養;氯化鈉維持滲透壓;慶大霉素為廣譜抗生素,對多數假單胞菌屬、變形桿菌屬、大腸菌群、葡萄球菌屬、需氧芽孢桿菌屬等多種革蘭氏陰陽性菌有較強的抗菌活性;結晶紫主要抑制革蘭氏陽性菌和念珠菌的生長;乳糖和蔗糖為可發酵碳源;酚紅為酸堿指示劑,洋蔥伯克霍爾德氏菌可氧化發酵蔗糖產少量酸,不發酵乳糖,生長時培養基微變黃色。

  USP42標準中洋蔥伯克霍爾德氏菌特征為生長帶有黃色光環的綠棕色菌落,或被粉紅色區域包圍的白色菌落。

  用法:稱取本品50.58g,加熱煮沸,完全溶解于1000mL蒸餾水中,分裝三角瓶,115℃高壓滅菌15分鐘,冷卻至50℃左右時,按每100mL培養基中加入過濾除菌的多粘菌素B 60000U和慶大霉素1mg,混勻,傾入無菌平皿,備用。

  洋蔥伯克霍爾德菌在含多粘菌素B、慶大霉素的BCSA瓊脂平板上的菌落為菌落呈淡黃色至淡紅色,表面光滑,周圍培養基變紅,結果如圖4所示:

洋蔥伯克霍爾德菌ATCC 25416

圖4 BCSA瓊脂(含多粘菌素B、慶大霉素)平板上的菌落特征

  含多粘菌素B、慶大霉素的麥康凱瓊脂原理:蛋白胨提供細菌生長的基本營養;氯化鈉維持滲透壓;多粘菌素B主要抑制多數革蘭氏陰性細菌的生長,慶大霉素為廣譜抗生素,對多種革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用;牛膽鹽主要可抑制革蘭氏陽性菌的生長;乳糖為可發酵碳源;中性紅為酸堿指示劑,洋蔥伯克霍爾德氏菌不發酵乳糖,菌落通常呈黃褐色或微紅色,周圍培養基通常不變色或因產堿變為橙黃色,而發酵乳糖的雜菌在培養基上則呈現桃紅色,菌落周圍可有沉淀環,與洋蔥伯克霍爾德氏菌區分開來。

  用法:稱取本品54.03g,加熱煮沸,完全溶解于1000mL蒸餾水中,分裝三角瓶,115℃高壓滅菌20分鐘,冷卻至50℃左右時,按每100mL培養基中加入過濾除菌的多粘菌素B 25000U和慶大霉素1mg,混勻,傾入無菌平皿,備用。

  洋蔥伯克霍爾德菌在含多粘菌素B、慶大霉素的麥康凱瓊脂平板上的典型菌落為淺黃褐色圓形菌落,表面光滑,周圍培養基通常不變色或因產堿變為橙黃色,結果如圖5所示:

洋蔥伯克霍爾德菌ATCC 25416

圖5 麥康凱瓊脂(含多粘菌素B、慶大霉素)平板上的菌落特征

4.3 鑒定

4.3.1 初篩

  自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個以上典型或可疑菌落,同一菌株接種于2支葡萄糖氧化/發酵管,其中一支加滅菌液體石蠟封口,另一支不封口,于36℃±1℃培養24h,二者均變黃為葡萄糖發酵型,未加石蠟管變黃而加石蠟管不變色為葡萄糖氧化型。同時在營養瓊脂平板上劃線純化,于36℃±1℃培養24 h,選擇葡萄糖氧化型(加石蠟管不變黃,不加石蠟管變黃)的純培養物繼續進行鑒定;洋蔥伯克霍爾德菌的葡萄糖生化管結果如圖6所示。

圖6 葡萄糖氧化/發酵管試驗結果

4.3.2 革蘭氏染色

  挑取可疑菌落涂片,進行革蘭氏染色。顯微鏡下觀察,洋蔥伯克霍爾德菌為革蘭氏陰性桿菌,如圖7所示。

圖7 革蘭氏染色鏡檢結果

4.3.3 氧化酶試驗

  用玻璃棒或一次性接種針挑取單個特征性菌落,涂布在氧化酶試劑濕潤的濾紙平板上。洋蔥伯克霍爾德菌為遲緩型氧化酶陽性(紫紅色、紫色或深藍色),反應時間約為2min~10min,如圖8所示。

  注:實驗中切勿使用鎳/鉻材料。

圖8 氧化酶試驗結果

4.3.4 過氧化氫酶試驗

  用玻璃棒或一次性接種針挑取單個特征性菌落,置于潔凈載玻片上,滴加3%過氧化氫溶液,觀察氣泡產生情況。洋蔥伯克霍爾德菌為遲緩產氣,1s后緩慢出現氣泡,如圖9所示。

圖9 過氧化氫酶試驗結果

4.3.5 蔗糖氧化

  挑取可疑菌落接種于蔗糖氧化培養基,36℃±1℃培養24h,培養基變黃色為陽性。洋蔥伯克霍爾德菌為陽性反應,如圖10所示。

圖10 蔗糖氧化試驗結果

4.3.6 枸櫞酸鹽利用

  挑取可疑菌落接種于西蒙氏枸櫞酸鹽培養基,36℃±1℃培養24h,培養基變藍色為陽性,綠色為陰性。洋蔥伯克霍爾德菌為陽性反應,如圖11所示。

圖11 西蒙氏枸櫞酸鹽利用結果

4.3.7 七葉苷利用

  挑取可疑菌落接種于七葉苷培養基,30℃±1℃培養24h,培養基變黑色為陽性,不變色為陰性。洋蔥伯克霍爾德菌為陽性反應,如圖12所示。

圖12 七葉苷利用結果

4.3.8 替代試驗

  可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統,根據4.3.1的初步判斷結果,對可疑菌落進行鑒定。

4.4 結果報告

  綜合以上試驗結果,報告10g(mL)樣品中檢出或未檢出洋蔥伯克霍爾德菌。


五、附錄:

  《GB/T 7918.1-1987 化妝品微生物標準檢驗方法 總則》樣品處理方法



相關標準:

GB/T 7918.1-1987 化妝品微生物標準檢驗方法 總則  點擊下載


SNT4684-2016進出口化妝品洋蔥伯克霍爾德菌檢驗方法  點擊下載


注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。


 

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