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檸檬酸桿菌的檢驗方法及結果判斷

林嬌嬌
錄入時間:2022-10-12 16:45:21 來源:青島海博生物

一、檸檬酸桿菌簡介

  檸檬酸桿菌(Citrobacter),革蘭氏陰性兼性厭氧菌。直桿菌、直徑約1.0μm,長2.0μm~6.0μm。有呼吸和發酵兩種代謝類型。氧化酶陰性,動力試驗、ONPG試驗陽性,能利用檸檬酸鹽,能夠液化明膠,DNA酶試驗和V-P試驗陰性。根據《伯杰氏細菌學分類手冊》,檸檬酸桿菌屬分為弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、科氏檸檬酸桿菌(C.diversus)和無丙二酸鹽檸檬酸桿菌(C.amalonaticus)三個種。


二、參考標準;

  《SN/T 2552.6-2010 乳與乳制品衛生微生物學檢驗方法 第6部分:檸檬酸桿菌檢驗》


三、檢測步驟及結果判斷

  3.1 增菌

  無菌稱取樣品100g,10g和1g各三份分別加入2000mL、250mL和100mL樣品稀釋瓶中,加入9倍預熱到45℃的滅菌蒸餾水(1:10稀釋),或者將樣品直接稱量到裝有9倍預熱到45℃的滅菌蒸餾水的樣品稀釋瓶中,振搖使樣品充分混勻,36℃±1℃培養18h~24h。

  分別移取培養18h~24h的懸液各10mL加入90mL四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯(TTB)中,36℃±1℃培養18h~24h。

  四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯(TTB)檢驗原理:

  蛋白胨和牛肉粉提供碳源、氮源和維生素,滿足細菌生長的需求;氯化鈉可維持均衡的滲透壓;碳酸鈣能中和細菌產酸及吸收有毒的代謝產物;硫代硫酸鈉和四硫磺酸鈉結合可抑制腸道共生菌(四硫磺酸鈉是在培養基加入碘和碘化鉀時形成),而具有四硫磺酸鈉還原酶的細菌能在此培養基中繁殖;膽鹽和煌綠可抑制大腸群菌和其它革蘭氏陽性細菌。

  四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯(TTB)用法:

  稱取本品93.55g,溶解于1050mL蒸餾水中,加熱煮沸,121℃高壓滅菌15分鐘,臨用前加入20%碘液 20mL,0.1% 煌綠10mL,現配現用,不宜久置。培養結果如圖1所示:

圖1 弗氏檸檬酸桿菌在TTB中的培養結果

  3.2 分離培養

  輕輕混勻增菌液,每份增菌液用接種環接種沙門氏菌志賀氏菌分離瓊脂(SS)平板、亞硫酸鉍瓊脂(BS)平板。采用三區法或四區法劃線,以獲得單個菌落。將平板倒置于36℃±1℃,SS瓊脂平板培養18h~24h,BS瓊脂平板培養40h~48h。

  從SS平板和BS平板上分別挑取3個~5個可疑菌落,在營養瓊脂斜面上純化培養。檸檬酸桿菌在SS瓊脂平板上的可疑菌落為圓形,粉紅色、黑色、無色菌落,或粉紅色、黑色中心菌落;在BS瓊脂平板上的可疑菌落為棕綠色或棕黑色菌落。

  SS瓊脂培養基檢驗原理:

  䏡胨、牛肉浸粉提供碳源、氮源、維生素和礦物質;乳糖為可發酵的糖類;三號膽鹽、枸櫞酸鈉和煌綠抑制革蘭氏陽性菌及大多數的大腸菌群和變形桿菌;硫代硫酸鈉和枸櫞酸鐵用于檢測硫化氫的產生,使菌落中心呈黑色;中性紅為pH指示劑,發酵糖產酸的菌落呈紅色,不發酵糖的菌落為無色;瓊脂是培養基的凝固劑。

  SS瓊脂培養基用法:

  稱取本品63.53g,溶解于1000mL蒸餾水中,加熱煮至沸,不必高壓蒸汽滅菌,冷至45℃-50℃倒成平板。培養結果如圖2所示:

圖2 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864在SS瓊脂平板上的培養結果

  亞硫酸鉍瓊脂(BS)檢驗原理:

  蛋白胨、牛肉粉在培養基中作為基礎營養物質,為細菌生長提供所需的氮源、碳源、維生素及一些礦物質等元素;葡萄糖可作為細菌生長代謝所需的能量物質;磷酸鹽對培養環境pH值起到緩沖作用;途G和亞硫酸鈉能抑制大腸桿菌、變形桿菌和革蘭氏陽性菌的生長。傷寒沙門氏菌及其他沙門氏菌能利用葡萄糖,將亞硫酸鹽還原成硫化物并與硫酸亞鐵反應使得菌落呈黑色,此外還可把鉍離子還原成金屬鉍,使菌落呈現金屬光澤,從而使沙門氏菌得到分離。

  亞硫酸鉍瓊脂(BS)用法:

  稱取本品50.3g,加入1000 mL蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,冷至45℃-50℃,搖勻,傾入無菌平皿備用。無需高壓滅菌。保存于黑暗處,48小時內使用。培養結果如圖3所示:

圖3 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864在BS瓊脂平板上的培養結果

  3.3 分離鑒定

  3.3.1 方法選擇

  對挑選的菌體進行革蘭氏染色,氧化酶試驗初步生化鑒定。革蘭氏染色陰性,氧化酶試驗陰性按3.3.2進行初步生化試驗。革蘭氏染色結果如圖4A,氧化酶試驗結果如圖4B:

圖4 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864革蘭氏染色結果,弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864氧化酶實驗結果

  3.3.2 初步生化鑒定

  使用營養瓊脂平板或斜面上純化分離的新鮮培養物(培養時間不超過24h)進行動力試驗、ONPG試驗、檸檬酸鹽試驗、DNA酶試驗(或明膠液化試驗)和V-P試驗。動力試驗、ONPG試驗和檸檬酸鹽試驗陽性,DNA酶試驗(或明膠液化試驗)和V-P試驗陰性的菌落為檸檬酸桿菌屬細菌。再次用營養瓊脂純化培養18h~24h后,進行后續生化試驗。初步生化鑒定結果如圖5所示:


圖5 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864初步生化鑒定結果

  3.3.3 生化鑒定

  使用營養瓊脂上的新鮮培養物(培養時間不超過24 h)按表1各項生化試驗進行檸檬酸桿菌各種的鑒定。確證鑒定結果如圖6所示:

表1 檸檬酸桿菌屬生化鑒定表

確證實驗

弗氏檸檬

酸桿菌

(C.freundii)

科氏檸檬

酸桿菌

(C.diversus)

無丙二酸鹽

檸檬酸桿菌

(C.amalonaticus)

水楊酸發酵產酸

V(﹣)

V

D-戊糖醇發酵產酸

產硫化氫

V(+)

鳥氨酸脫酸酶

V(﹣)

靛基質

丙二酸鹽利用

V(﹣)

注:+:≥90%陽性;(+):75%~89%陽性;d:不同菌株不定;(﹣):75%~89%陰性;﹣:≥90%陰性。


圖6 弗氏檸檬酸桿菌確證生化鑒定結果


四、結果判定與結果報告

  4.1 結果判定

  4.1.1 檸檬酸桿菌屬

  革蘭氏染色陰性,氧化酶實驗陰性,生化反應符合3.3.2要求的菌落,判定為檸檬酸桿菌屬細菌。

  4.1.2 檸檬酸桿菌

  革蘭氏染色陰性,氧化酶實驗陰性,生化反應結果與3.3.2和3.3.3中表1的生化反應結果相符,或根據生化鑒定試劑盒、生化鑒定系統鑒定到檸檬酸桿菌屬的結果,可判定為特定的檸檬酸桿菌。

  4.2 結果報告

  生化鑒定結果符合檸檬酸桿菌生化特性,按增菌培養的陽性瓶數,應用MPN表,查出每100 g樣品中的MPN值。檢測結果報告為每100 g樣品中檸檬酸桿菌(屬或種)的MPN值。

表2 最可能數(MPN)表(95%置信區間)

使用三管法,接種量分別為10.0 g,1.0 g和0.1 g。

陽性管數

MPN

/100g

可信限

陽性管數

MPN

/100g

可信限

10

1

0.1

10

1

0.1

0

0

0

<3.0

-

9.5

2

2

0

21

4.5

42

0

0

1

3.0

0.15

9.6

2

2

1

28

8.7

94

0

1

0

3.0

0.15

11

2

2

2

35

8.7

94

0

1

1

6.1

1.2

18

2

3

0

29

8.7

94

0

2

0

6.2

1.2

18

2

3

1

36

8.7

94

0

3

0

9.4

3.6

38

3

0

0

23

4.6

94

1

0

0

3.6

0.17

18

3

0

1

38

8.7

110

1

0

1

7.2

1.3

18

3

0

2

64

17

180

1

0

2

11

3.6

38

3

1

0

43

9

180

1

1

0

7.4

1.3

20

3

1

1

75

17

200

1

1

1

11

3.6

38

3

1

2

120

37

420

1

2

0

11

3.6

42

3

1

3

160

40

420

1

2

1

15

4.5

42

3

2

0

93

18

420

1

3

0

16

4.5

42

3

2

1

150

37

420

2

0

0

9.2

4.4

38

3

2

2

210

40

430

2

0

1

14

3.6

42

3

2

3

290

90

1000

2

0

2

20

4.5

42

3

3

0

240

42

1000

2

1

0

15

3.7

42

3

3

1

460

90

2000

2

1

1

20

4.5

42

3

3

2

1100

180

4100

2

1

2

27

8.7

91

3

3

3

>1100

420

-

注:如果接種量擴大10倍,分別為100.0g,10.0g和1g時,表中的數字相應縮小10倍。如果接種量縮小10倍,分別為1.0g,0.1g和0.01g時,表中的數字相應擴大10倍,其余類推。


相關標準:

SN/T 2552.6-2010 乳與乳制品衛生微生物學檢驗方法 第6部分:檸檬酸桿菌檢驗 點擊下載


相關產品:

四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎(TTB)-點擊查看產品詳情


SS瓊脂-點擊查看產品詳情


亞硫酸鉍瓊脂(BS)-點擊查看產品詳情


注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。

 

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