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空腸彎曲菌檢驗方法及結果判斷

張輝 林嬌嬌
錄入時間:2022-7-5 15:48:36 來源:青島海博生物

一、空腸彎曲菌簡介

  空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是彎曲菌屬中的一個亞種,是引起急性腹瀉的重要病原菌,許多國家報道,本菌從腹瀉病例的分離率為5%~14%,從無癥狀人群的糞便標本中分離率小于1%,目前已證明為人畜共患病菌。

  本菌為革蘭氏陰性菌,多形態,螺旋性,彎曲桿狀,有一個以上的螺旋并可長達8μm,也可出現S形或似飛翔的海鷗形;菌體一端或兩端有單根鞭毛,長度約為菌體的2~3倍,有活潑的動力或不產生動力;超過48h的培養物以衰老的球菌狀居多。

  本菌屬于微需氧菌,初次分離時需在含5%氧、85%氮和10%二氧化碳環境中,傳代后能在10%二氧化碳環境中生長,在多氧和絕對無氧的環境中均不生長。培養適宜溫度為25℃~43℃,培養最適溫度為42℃,最適pH值7.2。對糖類既不發酵也不氧化,呼吸代謝無酸性或中性產物,生長不需血清,從氨基酸或三酸循環獲得能量。

在布氏肉湯中生長呈均勻渾濁。在血瓊脂上,初次分離出現兩種菌落特征:第一型菌落不溶血、灰色、扁平、濕潤、有光澤,看上去像水滴,邊緣不規則,常沿劃線蔓延生長;第二型菌落也不溶血,常呈分散凸起的單個菌落(直徑1nm~2nm)邊緣整齊、半透明、有光澤、中心稍渾,呈單個菌落生長。

  在國內外標準(包括美國FDA、ISO、GB等標準)中,食品中空腸彎曲菌的檢驗通常是用Bolton肉湯進行選擇性增菌培養,然后利用改良CCD瓊脂和Skirrow血瓊脂進行選擇性分離,最后進行生化鑒定。


二、參考標準

  《GB 4789.9-2014食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 空腸彎曲菌檢驗》點擊下載


三、檢驗程序

  空腸彎曲菌檢驗程序見圖1。


圖1 空腸彎曲菌檢驗程序


四、檢驗方法及結果判斷

  4.1 樣品處理

  4.1.1 一般樣品

  取25g(mL)樣品(水果、蔬菜、水產品為50g)加入盛有225mL的Bolton肉湯的有濾網的均質袋中(若為無濾網均質袋可使用無菌紗布過濾),用拍擊式均質器均質1min~2min,經濾網或無菌紗布過濾,將濾過液進行培養。

  4.1.2 整禽等樣品

  用200mL的0.1%的蛋白胨水中充分沖洗樣品的內外部,并振蕩2min~3min,經無菌紗布過濾至250mL離心管中,16000g離心15min后棄去上清,用10mL的0.1%蛋白胨水懸浮沉淀,吸取3mL于100mL的Bolton肉湯中進行培養。

  4.1.3 貝類

  取至少12個帶殼樣品,除去外殼后將所有內容物放到均質袋中,用拍擊式均質器均質1min~2min,取25g樣品至225mL的Bolton肉湯中(1:10稀釋),充分震蕩后再轉移25mL于225mL的Bolton肉湯中(1:100稀釋),將1:10和1:100稀釋的Bolton肉湯同時進行培養。

  4.1.4 蛋黃液或蛋漿

  取25g(mL)樣品于125mL的Bolton肉湯中并混勻(1:6稀釋),再轉移25mL于100mL的Bolton肉湯中并混勻(1:30稀釋),同時將1:6和1:30稀釋的Bolton肉湯進行培養。

  4.1.5 鮮乳、冰淇淋、奶酪等

  若為液體乳制品取50g;若為固體乳制品取50g加入盛有50mL的0.1%蛋白胨水的有濾網均質袋中,用拍擊式均質器均質15s~30s,保留過濾液。必要時調整pH值至7.5±0.2,將液體乳制品或濾過液以20000g離心30min后棄去上清,用10mL的Bolton肉湯懸浮沉淀(盡量避免帶入油層),再轉移至90mL的Bolton肉湯進行培養。

  4.1.6 需表面涂拭檢測的樣品

  無菌棉簽擦拭檢測樣品的表面(面積至少100cm2以上),將棉簽頭剪落到100mL的Bolton肉湯中進行培養。

  4.1.7 水樣

  將4L的水(對于氯處理的水,在過濾前每升水中加入5mL 1mol/L硫代硫酸鈉溶液)經0.45μm濾膜過濾,把濾膜浸沒在100mL的Bolton肉湯中進行培養。

  4.2 預增菌與增菌

  在微需氧條件下,36℃±1℃培養4h,如條件允許配以100r/min的速度進行振蕩。必要時測定增菌液的pH值并調整至7.4±0.2,42℃±1℃繼續培養24h~48h。培養結果如圖2所示。

  Bolton肉湯原理:乳白蛋白水解物、動物組織酶解物提供碳、氮源;酵母浸膏提供各種維生素;氯化鈉維持均衡的滲透壓;丙酮酸鈉和偏亞硫酸氫鈉能中和培養基的有毒物質,也能增強培養基的空氣耐受力;α-酮戊二酸提供生長因子,促進空腸彎曲菌的生長;碳酸鈉提供空腸彎曲菌最有利的酸堿環境;頭孢哌酮和多粘菌素B抑制革蘭氏陰性菌的生長;萬古霉素和三甲氧芐嘧啶抑制革蘭氏陽性菌的生長;兩性霉素B抑制酵母和真菌的生長。

  Bolton肉湯用法:稱取基礎培養基27.6g,加入蒸餾水或去離子水1L,攪拌加熱煮沸至完全溶解,分裝三角瓶,121℃高壓滅菌15min。待Bolton肉湯基礎冷卻至45℃左右,在無菌條件下,每100mL基礎培養基加入5mL無菌裂解脫纖維羊或馬血和1支Bolton肉湯添加劑,混勻,備用。

  注:培養基高壓滅菌后有一些小黑色顆粒。

圖2 Bolton肉湯增菌培養結果

  4.3 分離

  將24h增菌液、48h增菌液及對應的1:50稀釋液分別劃線接種于Skirrow血瓊脂與mCCDA平板上,微需氧條件下42℃±1℃培養24h~48h。培養結果分別如圖4、圖3所示。另外可選擇使用空腸彎曲菌顯色平板作為補充。

  觀察24h培養與48h培養的瓊脂平板上的菌落形態,mCCDA平板上的可疑菌落通常為淡灰色,有金屬光澤、潮濕、扁平,呈擴散生長的傾向。Skirrow血瓊脂平板上的第一型可疑菌落為灰色、扁平、濕潤有光澤,呈沿接種線向外擴散的傾向;第二型可疑菌落常呈分散凸起的單個菌落,邊緣整齊、發亮。

  空腸彎曲菌顯色培養基上的可疑菌落按照說明進行判定。

  mCCDA原理:肉浸液、動物組織酶解物、酪蛋白酶解物提供碳、氮源,維生素,生長因子;氯化鈉維持均衡的滲透壓;木炭具有解毒、收集二氧化碳和改變表面張力的作用;去氧膽酸鈉為選擇性抑菌劑;頭孢哌酮可抑制普通腸道菌生長,兩性霉素B抑制酵母和真菌生長,利福平可抑制非彎曲菌其他厭氧菌的生長。硫酸亞鐵和丙酮酸鈉有利于空腸彎曲菌的生長;瓊脂是培養基的凝固劑。

  mCCDA用法:稱取本品51.5g,加入1L蒸餾水或去離子水中,攪拌加熱煮沸至完全溶解,分裝三角瓶,每瓶200mL,121℃高壓滅菌15min。待基礎培養基的冷卻至45℃左右時,加入1支改良CCD瓊脂添加劑(含頭孢哌酮6.4mg、兩性霉素B2mg和利福平2mg),混勻,傾入無菌平皿,備用。


空腸彎曲菌 CICC 22936
空腸彎曲菌 ATCC 33291

           圖3 mCCDA培養結果


  Skirrow瓊脂原理:蛋白陳、胰蛋白陳、酵母浸膏提供碳、氮源,維生素,生長因子;氯化鈉維持均衡的滲透壓;丙酮酸鈉、焦亞硫酸鈉、硫酸亞鐵有利于彎曲菌的生長。頭孢哌酮可抑制革蘭氏陰性細菌和部分革蘭氏陽性菌的生長;兩性霉素B抑制真菌生長;利福平可抑制非彎曲菌其他厭氧菌;瓊脂是培養基的凝固劑。

  Skirrow用法:稱取基礎培養基42.5g,加入蒸餾水或去離子水1L,攪拌加熱煮沸至完全溶解,分裝三角瓶,每瓶100mL,121℃高壓滅菌15min。待基礎培養基的冷卻至45℃左右時,加入1mL過濾除菌的FBP溶液、1支改良Skirrow氏瓊脂基礎添加劑和無菌凍溶脫纖維羊血5mL,混勻,傾入無菌平皿。預先制備的平板未干燥時在室溫放置不得超過4天或在4℃左右冷藏不得超過7天。


空腸彎曲菌 CICC 22936
空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖4 Skirrow瓊脂培養結果

  4.4 鑒定

  4.4.1 彎曲菌屬的鑒定

  4.4.1.1 概述

  挑取5個(如少于5個則全部挑。┗蚋嗟目梢删浣臃N到哥倫比亞血瓊脂平板上,微需氧條件下42℃±1℃培養24h~48h,生長情況如圖5所示。


空腸彎曲菌 CICC 22936
空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖5 哥倫比亞血瓊脂平板微需氧條件下42℃±1℃培養結果

  按照4.4.1.1~4.4.1.5進行鑒定,結果符合表1的可疑菌落確定為彎曲菌屬。

表1 彎曲菌屬的鑒定

項   目

彎曲菌屬特性

形態觀察

革蘭氏陰性,菌體彎曲如小逗點狀,兩菌體的末端相接時呈S形、螺旋狀或海鷗展翅狀a

動力觀察

呈現螺旋狀運動b

氧化酶試驗

陽性

微需氧條件下25℃±1℃生長試驗

不生長

有氧條件下42℃±1℃生長試驗

不生長

a有些菌株的形態不典型。b有些菌株的運動不明顯。

  4.4.1.2 形態觀察

  挑取可疑菌落進行革蘭氏染色,鏡檢。結果如圖6所示。

圖6 革蘭氏染色鏡檢結果

  4.4.1.3 動力觀察

  挑取可疑菌落用1mL布氏肉湯懸浮,用相差顯微鏡觀察運動狀態。

  4.4.1.4 氧化酶試驗

  用鉑/銥接種環或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶試劑潤濕的濾紙上,如果在10s內出現紫紅色、紫羅蘭或深藍色為陽性。結果如圖7所示。

圖7 氧化酶試驗結果

  4.4.1.5 微需氧條件下25℃±1℃生長試驗

  挑取可疑菌落,接種到哥倫比亞血瓊脂平板上,微需氧條件下25℃±1℃培養44h±4h,觀察細菌生長情況?漳c彎曲菌在該培養條件下不生長,培養結果如圖8所示。


空腸彎曲菌 CICC 22936
空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖8 哥倫比亞血瓊脂平板微需氧條件下25℃±1℃培養結果


  4.4.1.6 有氧條件下42℃±1℃生長試驗

  挑取可疑菌落,接種到哥倫比亞血瓊脂平板上,有氧條件下42℃±1℃培養44h±4h,觀察細菌生長情況?漳c彎曲菌在該培養條件下不生長,培養結果如圖9所示。


空腸彎曲菌 CICC 22936 
空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖9 哥倫比亞血瓊脂平板有氧條件下42℃±1℃培養結果

  4.4.2 空腸彎曲菌的鑒定

  4.4.2.1 過氧化氫酶試驗

  挑取菌落,加到干凈玻片上的3%過氧化氫溶液中,如果在30s內出現氣泡則判定結果為陽性。結果如圖10所示。


大腸埃希氏菌 ATCC 25922 
空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖10 過氧化氫酶試驗結果

  4.4.2.2 馬尿酸鈉水解試驗

  挑取菌落,加到盛有0.4mL的1%馬尿酸鈉的試管中制成菌懸液;旌暇鶆蚝笤36℃±1℃水浴中溫育2h或36℃±1℃培養箱中溫育4h。沿著試管壁緩緩加入0.2mL的茚三酮溶液,不要振蕩,在36℃±1℃的水浴或培養箱中再溫育10min后判讀結果。若出現深紫色則為陽性;若出現淡紫色或沒有顏色變化則為陰性。結果如圖11所示。

圖11 馬尿酸鈉水解試驗結果

  4.4.2.3 吲哚乙酸酯水解試驗

  挑取菌落至吲哚乙酸酯紙片上,再滴加一滴滅菌水。如果吲哚乙酸酯水解,則在5min~10min內出現深藍色;若無顏色變化則表示沒有發生水解。不同細菌在吲哚醋酸酯紙片上的生化反應現象如圖12所示。

圖12 吲哚乙酸酯水解試驗結果

  空腸彎曲菌的鑒定結果見表2。

表2 空腸彎曲菌的鑒定特征


空腸彎曲菌

(C. jejuni)

結腸彎曲菌

(C. coli)

海鷗彎曲菌

(C. lari)

烏普薩拉彎曲菌

(C. upsaliensis)

過氧化氫酶試驗

+

+

+

-或微弱

馬尿酸鹽水解試驗

+

-

-

-

吲哚乙酸酯水解試驗

+

+

-

+

注:+表示陽性;-表示陰性。

  4.4.2.4 替代試驗

  對于確定為彎曲菌屬的菌落,可使用生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡代替4.4.2.1~4.4.2.3進行鑒定。

  4.5 結果報告

  綜合以上試驗結果,報告檢樣單位中檢出或未檢出空腸彎曲菌。


相關標準:

GB 4789.9-2014 空腸彎曲菌檢驗 點擊下載


注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。


 

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