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口腔支原體固體平板培養法及染色鏡檢觀察

楊永帥
錄入時間:2021-11-1 11:41:20 來源:青島海博生物

一、支原體簡單介紹

  1.形態特征

  支原體是一類沒有細胞壁、高度多形性、能通過濾菌器、可用人工培養基培養增殖的最小原核細胞型微生物,大小為0.1-0.3微米。由于能形成絲狀與分枝形狀,故稱為支原體。

  2.生化分型

  常利用發酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反應鑒別支原體。 一般能分解葡萄糖的支原體則不能利用精氨酸,如肺炎支原體;能利用精氨酸的原體則不能分解葡萄糖,如口腔支原體、人型支原體;解脲支原體不能利用葡萄糖或精氨酸,但可利用尿素作能源。

  3.培養特性

  支原體對營養需求較高,一般需要在培養基中添加一定比例的動物血清,大多數兼性厭氧,有些在初分離時加入5%CO2生長更好。支原體生長緩慢,在含量較少的固體培養基上培養會出現典型的“荷包蛋樣”,核心部分較厚,向下長入培養基,周邊為一層薄的透明顆粒區。

  4.抵抗力

  支原體對熱的抵抗力與細菌相似。對環境滲透壓敏感,滲透壓的突變可致細胞破裂。對重金屬鹽、石炭酸、來蘇爾和一些面活性劑較細菌敏感,但對醋酸鉈、結晶紫和亞銻酸鹽的抵抗力比細菌大。對影響細胞壁合成的抗生素如素不敏感。


二、 二、口腔支原體檢驗依據及原理

  支原體廣泛存在于人和動物體內,是生物制品細胞培養生產工藝中常見的污染物,2020年版《中華人民共和國藥典》要求使用精氨酸支原體培養基培養檢測口腔支原體。具體操作要求為:將口腔支原體稀釋至10-3-10-5,接種在精氨酸支原體肉湯培養基內,每個稀釋度接種3支試管,置36℃培養7-14天,觀察培養基變色結果?谇恢гw可以利用培養基中的精氨酸,使培養基pH值升高,遇指示劑酚紅使培養基變紅。培養基中的豬胃消化粉、牛肉浸粉、酵母浸粉提供碳源、氮源、生長因子,氯化鈉維持滲透壓,酚紅為酸堿指示劑。


三、培養基配方(g/L):

豬胃消化粉

10.0

牛肉浸粉
5.0
酵母浸粉
5.0
氯化鈉
2.5
葡萄糖
1.0
L-精氨酸
2.0
酚紅
0.02
pH7.1±0.225


四、口腔支原體固體平板法的具體操作步驟及培養結果

  1.液體培養基活化

  吸取保存的口腔支原體原液100uL,加入到精氨酸支原體肉湯培養基中,封口膜纏住管口,37度需氧培養3-4天,可發現培養管澄清且變紅。說明有支原體生長且無雜菌污染。如下圖所示:

口腔支原體液體培養結果

  2.固體培養基二次活化

  吸取經過初次活化的支原體培養液100uL,涂布于精氨酸支原體固體培養基平板上,封口膜包住平板邊緣,37度培養6-10天,直到在光線下可以看到如下圖所示的針尖大小的菌落。


口腔支原體固體培養結果


五、口腔支原體常規切片觀察

  用消毒的小刀切割下一小塊瓊脂塊,放于載玻片上,低倍鏡下觀察,可看到支原體呈現典型的"荷包蛋樣"菌落,核心部分較厚,向下長入培養基,周邊為一層薄的透明顆粒區。


口腔支原體切片觀察



口腔支原體鏡檢結果觀察(低倍鏡)
口腔支原體鏡檢結果觀察(高倍鏡)


六、口腔支原體染色步驟及鏡檢結果

  為了增加顏色的對比度,更好的觀察檢測支原體,可采用加染色液的方式對支原體進行染色。中國藥典采用的為指示細胞培養法即DNA染色法,需要借助特殊的熒光染料和熒光顯微鏡進行觀察。而一般的實驗室并不具備這樣的條件,因此可以使用一種更為簡單的染色方法,借助兩種常見的染液及普通電子顯微鏡即可觀察。具體步驟為:將蕃紅染液或結晶紫染液稀釋10倍左右,直接加入到平板上染色10秒,之后用水沖洗掉,用小刀切割一塊瓊脂塊上顯微鏡觀察,可看到如下圖所示,染色使支原體更加清晰,明顯。下圖分別為蕃紅染色和結晶紫染色結果。


口腔支原體蕃紅染色結果


口腔支原體結晶紫染色結果(低倍鏡)


口腔支原體結晶紫染色結果(高倍鏡)


七、整個操作過程中的注意事項

  1.染液必須要稀釋,且染色時間不易過長,否則染色太深,觀察效果不好。

  2.平板可以倒薄一些,這樣切割下來的瓊脂塊會比較薄,便于光線的透過,觀察起來也會更加清晰明亮。

  3.不建議用菌液直接滴加到載玻片上,因為菌液本身含菌量太少,實測含菌量一般低于103/mL,因此難以快速發現支原體,且支原體為無色,與培養液混合后更難以在顯微鏡鏡下找到。

  4.固體培養基加血清倒板后,一定注意整個平板要完全透明無氣泡無雜質,如果平板狀態不好,會對后期結果的觀察造成干擾。


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注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。

 

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