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乳酸菌檢驗用培養基及生化反應詳解

許英俊
錄入時間:2021-8-30 15:31:07 來源:青島海博生物

一、乳酸菌介紹:
  乳酸菌是一類可發酵糖類產生大量乳酸的、無芽孢、革蘭氏陽性細菌的通稱。
  主要有乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和嗜熱鏈球菌屬(Streptococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和片球菌屬(Pediococcus)。

  乳桿菌屬菌體形態多樣,呈長桿狀、彎曲桿狀或短桿狀(圖1)。



圖1  乳桿菌的顯微形態

  雙歧桿菌呈短桿狀、纖細桿狀或球形,可形成各種分支或分叉等多形態,如Y字形、v字形、彎曲狀、勺形(圖2),典形形態為分叉桿菌,因而取名bifidus,不抗酸,無動力。  



圖2  雙歧桿菌的顯微形態

  嗜熱鏈球菌菌體呈球形、卵圓形或球桿狀,直徑為0.5μm~2.0μm,成對或成鏈排列(圖3)。  



圖3  嗜熱鏈球菌的顯微形態


二、檢驗標準和程序:

  《GB4789.35-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》中規定,乳酸菌的檢驗程序如下:


圖4  乳酸菌檢驗程序

  該檢驗程序中,共涉及3種培養基,本文將對它們分別進行詳細闡述。


三、主要培養基:
1、MRS培養基:
  該產品主要用于食品中乳酸菌的分離培養和計數。

  培養基成分(g/L)如下:

蛋白胨 
10.0
牛肉浸粉 
5.0
酵母浸粉 
4.0
葡萄糖 
20.0
磷酸氫二鉀 
2.0
檸檬酸三銨 
2.0
醋酸鈉 
5.0
硫酸鎂 
0.2
硫酸錳 
0.05
瓊脂 
15.0
吐溫80 
1.0
pH值6.2±0.2 
25℃


原理:
  蛋白胨、牛肉膏粉、酵母膏粉提供氮源、維生素、生長因子;葡萄糖為可發酵糖類;磷酸氫二鉀為酸堿緩沖劑;檸檬酸三銨、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80和醋酸鈉為培養各種乳酸菌提供生長因子,其成分還能抑制某些雜菌并中和細胞毒性物質,為乳酸菌提供一個良好的生長環境;瓊脂是培養基的凝固劑。
用法:
  稱取本品66.2g,加熱溶解于1000mL蒸餾水中,分裝,121℃高壓滅菌15-20分鐘,備用。
質控:
按標簽用法制備培養基,接種質控菌株,放置36±1℃需氧培養48±2小時,觀察結果(表1、圖5)。

表1   MRS培養基上各質控菌株的生長情況要求





圖5  MRS瓊脂上各質控菌株的生長狀態


2、莫匹羅星鋰鹽和半胱甘酸鹽酸鹽改良MRS培養基:
  顧名思義,就是通過添加某些成分對MRS培養基進行了改良。其基礎與MRS相同,使用HB0384-5或HB0384-6都可以,每200mL培養基中加入過濾除菌的莫匹羅星鋰鹽10mg和半胱氨酸鹽酸鹽0.1g。使用海博公司的產品的實際添加量為:
  莫匹羅星鋰鹽(HB0384-6a):1支/100mL;
  半胱氨酸鹽酸鹽(HB0384-11a):1支/200mL。
原理:

  莫匹羅星是一種抗生素,主要用于殺滅皮膚表面的革蘭氏陽性球菌,對一些革蘭氏陰性細菌有一定的抗菌作用(圖6)。加入本培養基中,可以抑制乳桿菌和嗜熱鏈球菌等雜菌的生長。



圖6  莫匹羅星鋰鹽添加劑及相關產品

  L-半胱氨酸是一種具有生理功能、在自然界廣泛存在的重要物質。它在動植物體內是各組織細胞用來防御有害物質和增加活力的一種氨基酸,并且是唯一具有活性巰基(-SH)的氨基酸,具有促進蛋白質合成、刺激生長、增加脂肪分解、增強免疫的作用,添加在該產品中,可以使培養基維持較低的氧化還原電位,促進厭氧菌雙歧桿菌的生長(圖7)。



圖7  半胱氨酸鹽酸鹽添加劑及相關產品
用法:
  稱取本品66.2g,加熱溶解于1000 mL蒸餾水中,分裝,121℃高壓滅菌15-20分鐘,冷至48℃左右時,每200 mL培養基中加入過濾除菌的莫匹羅星鋰鹽10mg和半胱氨酸鹽酸鹽0.1g,混勻,傾入無菌平皿,備用。
質控:
  按標簽用法制備培養基,接種以下質控菌株,放置36±1℃厭氧培養48±2小時,觀察結果(表2、圖8)。

表2   改良MRS培養基上各質控菌株的生長情況要求



圖8  改良MRS培養基上各質控菌株的生長狀態

3、MC瓊脂培養基:
  該培養基主要用于食品中嗜熱鏈球菌總數測定。 

  成分(g/L)如下 :

大豆蛋白胨 
5.0
牛肉浸粉 
3.0
酵母浸粉 
3.0
葡萄糖 
20.0
乳糖 
20.0
碳酸鈣 
10.0
瓊脂 
15.0
中性紅 
0.05
pH值6.0±0.1 
25℃

原理:
  大豆蛋白胨、牛肉膏粉和酵母膏粉能提供氮源、維生素和生長因子;葡萄糖和乳糖為可發酵糖類提供碳源;乳酸菌發酵糖產酸使菌落周圍碳酸鈣溶解,以辨別乳酸菌;瓊脂是培養基的凝固劑;中性紅為pH指示劑。
用法:
  稱取本品80.0g,加熱煮沸溶解于1000mL蒸餾水中,121℃高壓滅菌15分鐘,備用。
質控:
  按標簽用法制備培養基,接種以下質控菌株,放置36±1℃需氧培養48±2小時,觀察結果(表3、圖9)。

表3  MC瓊脂上各質控菌株生長的要求





圖9  MC瓊脂上各質控菌株的生長情況


四、乳酸菌的生化鑒定:
  有時為了確定菌種的種類和純度,需要對接種的菌種或分離出的菌株做進一步鑒定,乳酸菌最常用的生化鑒定方法就是碳水化合物的生化反應,下面對三種乳酸菌的生化反應現象逐一說明。相關表格引自《GB4789.35-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》和《GB4789.34-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 雙歧桿菌檢驗》。
1、乳桿菌的碳水化合物反應
  常見乳桿菌的碳水化合物反應標準和現象如表4。
表4  常見乳桿菌屬內種的碳水化合物反應

菌種
碳水化合物
七葉苷
纖維二糖
麥芽糖
甘露醇
水楊苷
山梨醇
蔗糖
棉子糖
植物乳桿菌
+
+
+
+
+
+
+
+
干酪乳桿菌
+
+
+
+
+
+
+
-
德氏乳桿菌
-
-
-
-
-
-
-
-


2、嗜熱鏈球菌的生化反應
  常見嗜熱鏈球菌的主要生化反應標準和現象如表5。

表5  常見嗜熱鏈球菌的主要生化反應

菌種
菊糖
乳糖
甘露醇
水楊苷
山梨醇
馬尿酸
七葉苷
嗜熱鏈球菌
-
+
-
-
-
-
-


3、雙歧桿菌的主要生化反應
  常見雙歧桿菌的主要生化反應標準和現象如表6。

表6  常見雙歧桿菌的主要生化反應

菌種
碳水化合物
鼠李糖
甘露醇
山梨醇
七葉苷
水楊苷
纖維二糖
乳糖
蔗糖
棉子糖
葡萄糖
嬰兒雙歧桿菌
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
長雙歧桿菌
-
-
-
+
-
-
+
+
+
+


五、注意事項:
  在乳酸菌檢驗中,需要注意的地方有兩個,其一為樣品處理方式,其二為生化試驗細節。
  1、樣品的稀釋,遵循常規用量,即25.0g/mL樣品加入225g/mL生理鹽水中進行稀釋。但是對于冷凍樣品,在稀釋之前首先要進行解凍,對于解凍方式,標準作了明確規定:2-5℃條件下解凍,應少于18h或低于45℃條件下15分鐘內解凍完畢,然后進行下一步操作。
  2、在進行生化反應的過程中需要注意:
  (1)接菌:必須為培養基平板純培養出的新鮮培養物; 
  (2)覆蓋石蠟:標準中規定,對于厭氧菌要加入液體石蠟后進行培養,但實際試驗表明,不管對于兼性厭氧菌還是嚴格厭氧菌,加不加石蠟結果均一致,這個并不影響結果的判斷,操作時盡量按照標準要求即可。 
  (3)培養時間:通常18h即可觀察結果,現象不明顯者可適當延長至24h。 
  (4)標準比對:對于有些生化反應,雖然標準中列出呈陽性或陰性反應,但實際試驗時并不能一定得到這種結果,也就是不能與標準達到100%的符合,這并不是生化管產品的問題,可能是菌株差異所致,因為標準中所描述的陽性和陰性反應,都是以90%以上的菌株為范圍的(如圖10),并不是絕對所有的菌株都能達到這種反應。對于偶爾出現的這種現象,要理性對待,可以視情況選擇其他的鑒定方法,對鑒定結論相互印證。


圖10  標準中對于生化反應符合性的備注說明

補充說明:

  該標準涉及的內容較多,本次列出的是常規性的一些內容,有關計數方式和培養基的具體選擇問題,將在后續的文章中繼續探討。


相關產品:

MRS培養基-點擊查看產品詳情


莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養基-點擊查看產品詳情


MC培養基-點擊查看產品詳情


相關標準:

《GB 4789.35-2016 乳酸菌檢驗》 點擊下載


GB 4789.34-2016 雙歧桿菌檢驗 點擊下載


注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。


 

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